イノシトール燐脂質分布の定量的解析

肌醇磷脂分布的定量分析

基本信息

批准号：
18050012
负责人：
藤本豊士
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

ホスファチジルイノシトール(PI)のイノシトール基の3,4,5位が燐酸化されることによって生じるイノシトール燐脂質(PIs)は,細胞内小胞輸送やシグナル伝達に重要な役割を果たすことが知られている.PIsの膜内二次元分布をナノスケールで解析し,細胞内超微構造との関連を明らかにすることはPIsの生理的機能をさらに詳細に理解するために重要である.従来の方法では微細な脂質局在を解明することが原理的に困難であると考えられるため,我々は急速凍結した細胞膜を白金・カーボン薄膜で物理的に固定する凍結割断レプリカを用いてPIsの超微局在を可視化し,定量的に解析する方法を創出した.既に昨年度までの研究で特異性,標識効率性などが十分に確保されたPI(4,5)P2に対するプローブ(GST-PH)を用いて,急速凍結して得た培養細胞のレプリカを標識,解析した.その結果,平坦な細胞膜のPI(4,5)P2は弱いクラスターを形成して存在すること,上記のクラスターはコレステロール抽出でやや低下するが,アクチン脱重合でほぼ完璧に消滅すること,PI(4,5)P2は特にカベオラ周囲に顕著に集中すること,細胞内カルシウム上昇によって標識は激減するが,生理的リガンドによる刺激ではカベオラ周囲のPI(4,5)P2が保たれる場合が多いことなどが明らかとなった.これらの結果は生細胞でのPI(4,5)P2の分布をナノスケールで初めて明らかにしたものであり,カベオラが平坦な細胞膜部分とは異なる特殊な領域を形成することを示した点で重要である.

已知通过磷酸化磷脂酰肌醇（PI）的3、4和5位产生的肌醇磷脂（PI）在细胞内囊泡转运和信号传导中起重要作用。分析PI在纳米级处的膜内二维分布并阐明与细胞内超微结构的关联对于对PIS生理功能的更详细理解非常重要。据认为，使用常规方法很难理解精细的脂质定位，我们创建了一种使用冷冻断裂复制品可视化PI的超铁定位的方法，该复制品可以物理固定用铂和碳薄膜快速冷冻细胞膜，并进行定量分析。在研究到去年之前，已经确保具有足够特异性和标记效率的PI（4，5）P2。我们通过使用探针（GST-PH）快速冷冻获得的培养细胞的复制品标记和分析。 The results revealed that PI(4,5)P2 on the flat cell membrane exists in weak clusters, the above clusters are slightly reduced by cholesterol extraction, but almost completely disappeared by actin depolymerization, and PI(4,5)P2 is particularly prominently concentrated around the caveolae, and although intracellular calcium rises, the labeling decreases dramatically, PI(4,5)P2 around the用生理配体刺激时，通常会保持小窝。这些结果是第一个揭示PI（4,5）P2在活细胞中分布的纳米级，并且很重要，因为它表明Caveolae形成了一个与扁平细胞膜部分不同的特殊区域。