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新規脂質滴蛋白質の解析による膜ミクロドメイン制御機構の解明

通过分析新型脂滴蛋白阐明膜微区控制机制

基本信息

批准号：
15024229
负责人：
藤本豊士
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15024229/
关键词：
脂質滴 ADRP two-hybrid ARF1 brefeldin A

项目摘要

細胞内の脂質滴にはカベオリンが局在し,細胞膜のコレステロール濃度調節などを通じて,細胞の増殖制御機構に関与すると考えられる.脂質滴構成蛋白質であるADRPはコレステロールとの結合性を持ち,脂質滴に貯蔵されたコレステロールエステルの動態に関わると予想される.本年度の研究では,ADRPの生理的役割を解明するために,ADRPと結合する分子を得る目的で酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行い,ARF1を同定した.GST-ADRPによるpull-down, GFP-ADRPおよびHA-ARF1の免疫沈降,さらに内在性蛋白質の免疫沈降により,ADRPとARF1の結合を確認した.ARF1のwild-type, GTP結合型mutant(Q71L),GDP結合型mutant(T31N)とADRPの結合性を比較し,T31N>Q71Lであることを見出した.哺乳類細胞に発現させたGFP-ARF1(T31N)とADRPの結合も共沈により確認した.ARF1-GEFの阻害剤であるBFA投与,ARF1(T31N)の発現によりADRPが脂質滴から脱落し,脂質滴が縮小する傾向が認められた.ADRP分子内でARF1との結合する部位を検索するためにADRP(1-181),DRP(174-282),ADRP(277-426)の3者とARF1の結合性をtwo-hybrid法で比較し,ADRP(174-282)のみが強い結合をすることを見出した.脂質滴に局在することが判明しているADRP(1-181),ADRP(277-426),ADRP(full-length)のうち,BFA存在下でも前2者は脂質滴に局在し,上の結果と一致した.以上より,ADRPの脂質滴への局在はARF1が関与することが明らかになり,脂質滴がBFAの新たな作用点であることが示された.

The lipid droplets in the cell are regulated by the concentration of lipid in the cell membrane, and the growth control mechanism of the cell is related to the regulation of lipid concentration. Lipid droplets constitute protein, ADRP, and lipid droplets are stored in the protein. This year's research aimed to clarify ADRP's physiological function, to identify ADRP binding molecules, to identify ARF1 by yeast two-hybrid method, to identify GST-ADRP pull-down, GFP-ADRP and HA-ARF1 immunosedimentation, to identify ADRP binding to ARF1 by immunosedimentation of intrinsic proteins, to identify ARF1 wild-type, GTP-binding mutant(Q71L), GDP binding mutant(T31N) and ADRP binding property comparison, T31N> Q71L Identification of the binding sites of GFP-ARF1 (T31N) and ADRP in mammalian cells. BFA administration, ARF1 (T31N) inhibition, ADRP lipid drop shedding, ADRP lipid drop shrinking tendency. ADRP intramolecular ARF1 binding sites, ADRP (1-181),DRP(174-282), ADRP(1- 183), ADRP(1- 184), ADRP(1-ADRP(277-426) and ARF1 have been compared by two-hybrid method,ADRP(174-282) and ARF1 have been compared by two-hybrid method. ADRP(1-181),ADRP(277-426),ADRP(full-length) and BFA were identified in the presence of lipid drop. The above,ADRP lipid droplets in the ARF1 and the new point of action of lipid droplets BFA.