新規脂質滴蛋白質の解析による膜ミクロドメイン制御機構の解明

通过分析新型脂滴蛋白阐明膜微区控制机制

• 批准号: 15024229
• 负责人: 藤本 豊士
• 金额: $ 2.88万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15024229/
• 关键词: 脂質滴; ADRP; two-hybrid; ARF1; brefeldin A

細胞内の脂質滴にはカベオリンが局在し,細胞膜のコレステロール濃度調節などを通じて,細胞の増殖制御機構に関与すると考えられる.脂質滴構成蛋白質であるADRPはコレステロールとの結合性を持ち,脂質滴に貯蔵されたコレステロールエステルの動態に関わると予想される.本年度の研究では,ADRPの生理的役割を解明するために,ADRPと結合する分子を得る目的で酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行い,ARF1を同定した.GST-ADRPによるpull-down, GFP-ADRPおよびHA-ARF1の免疫沈降,さらに内在性蛋白質の免疫沈降により,ADRPとARF1の結合を確認した.ARF1のwild-type, GTP結合型mutant(Q71L),GDP結合型mutant(T31N)とADRPの結合性を比較し,T31N>Q71Lであることを見出した.哺乳類細胞に発現させたGFP-ARF1(T31N)とADRPの結合も共沈により確認した.ARF1-GEFの阻害剤であるBFA投与,ARF1(T31N)の発現によりADRPが脂質滴から脱落し,脂質滴が縮小する傾向が認められた.ADRP分子内でARF1との結合する部位を検索するためにADRP(1-181),DRP(174-282),ADRP(277-426)の3者とARF1の結合性をtwo-hybrid法で比較し,ADRP(174-282)のみが強い結合をすることを見出した.脂質滴に局在することが判明しているADRP(1-181),ADRP(277-426),ADRP(full-length)のうち,BFA存在下でも前2者は脂質滴に局在し,上の結果と一致した.以上より,ADRPの脂質滴への局在はARF1が関与することが明らかになり,脂質滴がBFAの新たな作用点であることが示された.

The intracellular lipid droplets are localized, the concentration of the cell membrane is regulated, and the cell's reproductive control mechanism is examined. Lipid droplets make up protein ADRPのbinding properties, lipid droplet retention, lipid droplets Dynamic に关わると思される. This year's research では, ADRP のphysiological cutting を unraveling するために, ADRP とcombination molecule をget る purpose でYeast two-hybrid methodによるスクリーニングを行い,ARF1を同定した.GST-ADRPによるpull-down, GFP-ADRPおよびHA-ARF1のimmunoprecipitation, intrinsic proteinのimmunoprecipitationにより, ADRPとARF1のbinding confirmationした.ARF1wild-type, Comparison of GTP-binding mutant (Q71L), GDP-binding mutant (T31N) and ADRP binding, T31N>Q7 A RF1-GEF's inhibitory effect is BFA injection, ARF1(T31N)'s appearance and ADRP's lipid droplets are shed, and lipid droplets are reduced and reduced. The tendency is to recognize the binding site of ARF1 within the ADRP molecule and to bind it to the ADRP(1-181),DRP(174-2 82), ADRP(277-426), comparison of 3 persons and ARF1 combination, two-hybrid method, ADRP(174-282) )のみがstrongいcombinationをすることを见出した. Lipid drop bureau is clear in することが しているADRP(1-181),ADRP(277-4 26), ADRP (full-length), in the presence of BFA, the first two are lipid droplets, and the results above are consistent. The above results are consistent.り, ADRP's lipid droplet's bureau is in はARF1's relationship with することが明らかになり, lipid droplet's new たなaction point is であることがshows された.

项目成果

Aoki, T., Kogure, S., Kogo, H., Hayashi, Y., Ohno-Iwashita, Y., Fujimoto, T.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways"Acta Histochem.Cytochem.. 36. 165-171 (2003)

Aoki, T.、Kogure, S.、Kogo, H.、Hayashi, Y.、Ohno-Iwashita, Y.、Fujimoto, T.：“交联膜分子以两种不同途径螯合到小窝”《组织化学学报》。

Nakamura, N., Fujimoto, T.: "Adipose-differentiation-related protein has two independent domains for targeting to lipid droplets"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 306. 333-338 (2003)

Nakamura, N., Fujimoto, T.：“脂肪分化相关蛋白有两个独立的结构域用于靶向脂滴”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 306. 333-338 (2003)