変異リボトキシンを用いたリボソーム暗号解読中心の研究

研究重点是使用突变核毒素破译核糖体密码

• 批准号: 08458179
• 负责人: 正木 春彦
• 金额: $ 5.44万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08458179/
• 关键词: リボソーム; コリシン; リボトキシン; ヌクレアーゼ; インヒビター; 特異性; タンパク質間相互作用; NMR; 結合特異性; 大腸菌

1.コリシンE3,E4,E6のC末端ドメインE3C,E4C,E6Cと,E3Cの活性中心変異体(E517Q),およびそれぞれのインヒビターImmE3,ImmE4,ImmE6と,E3耐性を獲得したImmE6点変異体(W47C)を精製し,各Cドメインのリボソーム失活活性,リボソームの結合特性,Immとの結合特性といった分子レベルでの特異性を,各imm遺伝子の各コリシンに対する耐性度(免疫性)という生物学的特異性と対照させた.まず,E4CとE6Cはいずれもリボソームに対しE3Cと同一の作用様式を持つことを明らかにした.さらにC/Immの解離平衡定数Kdが10^<-8>M以上ではコリシン感受性となり,効果的な1アミノ酸置換でKdは1桁小さくなって辛うじて耐性を獲得すること,この閾値は,Immと結合が競争関係にあるリボソームとCドメインとのKdが規定していること,またKdは結合ではなく解離の速度定数だけで決定されていることが判明し,正しい複合体では大きな構造変化の起こっている可能性が考えられた.2.NMRによりE6CとImmE6の立体構造を決定した.E6Cは逆平行5本鎖βシートを骨格とし,β3-β4上に活性中心があり,シートに対して裏側のβ1-β2のループの付け根に特異性決定基がある.ImmE6は先に決定していたImmE3に似て,逆平行4本鎖βシートとループから成り,特異性決定基はシートの端に存在していた.chemical-shift perturbationでE6C,ImmE6両分子の結合面を同定した.さらに遺伝学的に推定していた特異性決定基,E6CのA496とImmE6のW47間に分子間NOEを観測し,これらが直接相互作用していることがわかった.また遊離のImmE6分子上では,二つの特異性決定基H5とW47間に側鎖間NOEを見出し,協同性が推定された.

1. The active center variant of E3,E4, and E6, E3C, E4C, E6C, and E3C (E517Q), the currently available C-terminal variants ImmE3,ImmE4,ImmE6, and E3 have been refined to obtain resistance. The ImmE6-point variant (W47C) has been refined to inactivate the activity of each C-terminal element, the binding properties of the C-terminal element, and the binding properties of the Imm "molecule. Each imm gene has its own tolerance (immunity) and biological specificity. E4C and E6C are opposite to each other. E3C and the same action are opposite to each other. The dissociation equilibrium constant Kd of C/Imm is 10^ M or more<-8>, the sensitivity of C/Imm is 10^ M or more, the acid substitution Kd of C/Imm is 10^M or more, the tolerance of C/Imm is 10 ^M or more, the threshold value of C/Imm is 10 ^M or more, the dissociation equilibrium constant Kd of C/Imm is 10 ^M or more, the sensitivity of C/Imm is 10 ^M or more, the acid substitution Kd of C/Imm is 10 ^M or more, the tolerance of C/Imm is 10 ^M or more, the threshold value of C/Imm is 10 ^M or more, the dissociation equilibrium constant Kd of C/Imm is 10 ^M or more, the dissociation velocity of C/Imm is 10 ^M or more, the dissociation velocity of C/Imm is 10 ^M or more, the dissociation velocity of C/Imm is 10 ^M or more. 2. NMR determined the stereostructure of E6C and ImmE6. E6C determined the active center of β3-β4 in the anti-parallel 5-locked-beta structure, β1-β2 in the anti-parallel 5-locked-beta structure, and ImmE6 determined the root-specific determinant in the anti-parallel 5-locked-beta structure. The specificity determining group is present at the end of the molecule.Chemical-shift perturbation is E6C, ImmE6C binding surface is identical. The molecular NOE between E6C and A496 and ImmE6 and W47 was determined by molecular chemistry. The free ImmE6 molecule was found to have two specific determinants between H5 and W47, and NOE was found to be synergistic.

项目成果

Nojima,T.et al: "Pyridine-promoted factor- and energy-free peptide synthesis systems prepared from various organisms including prokarytote,eukaryote and mitochondria." J.Biochem.119. 1076-1079 (1996)

Nojima,T.等人：“由原核生物、真核生物和线粒体等多种生物体制备的吡啶促进因子和无能量肽合成系统。”

Sano,M.et al: "Isolation and characterization of the nuclease O gene (nucO) from Aspergillus oryzae." Curr.Genet.30. 312-317 (1996)

Sano,M.等人：“米曲霉核酸酶 O 基因 (nucO) 的分离和表征。”

Kageyama,M.et al: "Construction and characterization of pyocin-colicin chimeric proteins." J.Bacteriol.178. 103-110 (1996)

Kageyama,M.等人：“化脓菌素-大肠菌素嵌合蛋白的构建和表征。”

Suzuki,T.et al: "Polysemous codon--A codon with multiple amino acid assignment caused by dual specificity of tRNA identity" EMBO J.16. 1122-1134 (1997)

Suzuki,T.et al：“多义密码子——由 tRNA 身份的双重特异性引起的具有多个氨基酸分配的密码子”EMBO J.16。

Tomita,K.et al: "Two nucleotides 5'-adjacent to the anticodon of rat cytoplasmic tRNAAsp are not edited?" Biochimie. 78. 1001-1006 (1997)

Tomita,K.et al：“与大鼠细胞质 tRNAAsp 反密码子 5 相邻的两个核苷酸未被编辑？”