蛋白質の高次構造形成過程をターゲットとしたドミナントネガティブ変異体作成系の確立

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本研究は、遺伝情報発現の後期段階をターゲットとした変異体作成技術の確立を、次の2つの実験から目指した。すなわち、1.タンパク質のC末端断片をトランスに供給し、野性型タンパク質の折り畳み反応を阻害する系、および、2.DNA結合タンパク質と標的DNA分子との相互作用を特異的にトランスに抑制する生体物質を選択する系の開発である。研究成果を以下にまとめる。1-(1).イソロイシルtRNA合成酸素C末断片(568-939)を大腸菌内で大量発現し、変性条件で精製した。精製した全長イソロイシルtRNA合成酸素(1-939)をC末断片(568-939)共存下で、試験管内変性・再変性を行うと、C末断片の非存在下に比べ、イソロイシルtRNA合成酸素の活性再構成が著しく阻害された。1-(2). Mycエピトープを付与したC末断片(568-939)を作成し、大腸菌細胞内で発現させた。抗Myc抗体による免疫沈降物を抗イソロイシルtRNA合成酸素抗体を用いてウエスタンブロット解析したところ、全長イソロイシルtRNA合成酸素がC末断片(568-939)と共に、免疫沈降していることがわかった。細胞内で、C末断片が野性型酸素と相互作用していることを証明した2. ラクトースオペロン制御領域のオペレーター部位にOct転写因子標的DNA配列を挿入した改変ラクトースオペロン制御領域をプラスミド上で作成し、これをlambdaファージベクターを用いて大腸菌染色体上に組み込み、Oct転写因子と標的遺伝子の相互作用をモニターする大腸菌試験株を作成した。この試験株は、X-Galを含む寒天培地上で青いコロニーを形成するが、その菌内でOct-3転写因子を発現させると白いコロニーを形成するようになる。プライマー伸長法により、転写開始点を同定し、ノザンブロット実験から、この表現系の変化が転写物の変化と関係していることを確認した。