F_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの固体NMR法による構造解析

固态NMR法分析F_0F_1-ATP合酶c亚基的结构

• 批准号: 11169214
• 负责人: 藤原 敏道
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University (2000)Yokohama National University (1999)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169214/
• 关键词: 固体NMR; 安定同位体標識; タンパク質高次構造; F_0F_1-ATP合成酵素; 膜タンパク質; F_oF_1-ATP合成酵素

固体NMR測定のために安定同位体を用いたF_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの調製法を確立し,固体NMR実験を行った。アミノ酸配列特異的に同位体標識を行える有機化学的な方法では,最初に79残基の全配列を固相法で一度に合成しする.cサブユニットの精製は,主に逆相HPLCを用いて行う.この方法の収率は5%程度であったので,比較的安価に固体NMR試料を作れるようになった.今年度はこの方法で,異なる分子鎖上にあるAla24C^βとAla64C^αのみを^<13>C標識したサブユニットcを有機合成した.この試料について核間距離を測定するため,サブユニットcを生体膜に再構成して,NMR線幅が0.5ppm程度になり分解能が最も高くなる測定条件を求めた.^<13>C,^<15>N完全標識には,大腸菌の大量発現系を用いた.精製は,有機溶媒を用いる方法で効率よく精製できることがわかり,現在大量培養を行っている.これら試料を用いることにより,固体NMR法で全構造の解析ができると考えられる.このことを明らかにするために,溶液NMRで決めた化学シフトに基づいて正確にシミュレートした3次元固体NMRスペクトルについて,各残基の信号を分離して帰属できるかどうかを調べた.その結果,隣接するC^α炭素間などについての3次元等方化学シフト相関スペクトルを測定することにより,信号幅が1ppm程度ならば,ほぼすべての信号帰属が可能なことがわかった.また,今年度はこれ以外に,多次元相関スペクトルを用いて実際のペプチドの^<13>Cと^<15>N信号の帰属が可能なことを,15残基のペプチドであるマストパランXに応用して,二次構造を求められることを確かめた.まだサブユニットcの構造決定に至っていないが測定条件と測定法の確立により,これからの固体NMRによる構造決定のための基礎ができた.

A modulation method for the determination of stable isotopes by solid-state NMR was established. The method of organic chemistry for the identification of acid sequence-specific isotopes was carried out by solid phase synthesis of 79 residues in the first place. The method yields up to 5% of the sample, compared to the solid-state NMR sample. This year, the method of molecular lock Ala24C^β and Ala64C^<13>α is used to identify the organic synthesis. For the determination of the internuclear distance of the sample, the determination conditions of the maximum decomposition energy of the sample can be obtained by determining the composition of the biological film and the NMR amplitude of 0.5 ppm.^ <13>C,^<15>N Complete identification of E. coli in large numbers. Refined, organic solvent is used in the method of purification, now a large number of cultivation is carried out. Solid state NMR method is used to analyze the whole structure. In this case, solution NMR was used to determine the chemical structure of the base, and the signal of each residue was separated. As a result, the 3-D isocube chemical correlation between adjacent C^α carbon atoms was determined. The signal amplitude was about 1ppm. In addition to this, the multiple element <13><15>correlation is used to determine the identity of the 15 residue sequence. The determination of structure of solid state NMR is based on the determination of measurement conditions and methods.

项目成果

藤原敏道: "固体核磁気共鳴法"蛋白質 核酸 酵素. 44・4. 582-589 (1999)

藤原俊道：“固态核磁共振法”蛋白质核酸酶44・4（1999）。

Sumie Yoshioka: "Molecular Mobility of Protein in Lyophilized Formulations Linked to the Molecular Mobility of Polymer Excipients, as Determined by High Resolution ^<13>C Solid-State NMR"Pharmaceutical Research. 16. 1621-1625 (1999)

Sumie Yoshioka：“冻干制剂中蛋白质的分子迁移率与聚合物赋形剂的分子迁移率相关，通过高分辨率13 C固态NMR测定”药物研究。

Toshimichi.Fujiwara: "Compound Radio-Frequency Driven Recoupling Pulse Sequences for Efficient Magnetization Transfer by Homonuclear Dipolar Interaction under Magic Angle Spinning Conditions."J.Magn.Reson.,. 145. 73-83 (2000)

Toshimichi.Fujiwara：“复合射频驱动重耦合脉冲序列，用于在魔角旋转条件下通过同核偶极相互作用实现有效磁化转移。”J.Magn.Reson.,。

Suhkman Kim: "Osmotic Stability of Muramyl Dipeptide-Bearing Liposomes and Molecular Miscibility in Their Membranes"Bull.Chem.Soc.Jpn.,. 72. 541-548 (1999)

Suhkman Kim：“含胞壁酰二肽的脂质体的渗透稳定性及其膜中的分子混溶性”Bull.Chem.Soc.Jpn.,。

Suhkman Kim: "Osmotic Stability of Muramyl Dipeptide-Bearing Liposomes and Molecular Miscibility in Their Membranes"Bull. Chem. Soc. Jpn.. 72. 541-548 (1999)

Suhkman Kim：“携带胞壁酰二肽的脂质体的渗透稳定性及其膜中的分子混溶性”公牛。