F_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの固体NMR法による構造解析

固态NMR法分析F_0F_1-ATP合酶c亚基的结构

• 批准号: 11169214
• 负责人: 藤原 敏道
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Osaka University (2000)Yokohama National University (1999)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11169214/
• 关键词: 固体NMR; 安定同位体標識; タンパク質高次構造; F_0F_1-ATP合成酵素; 膜タンパク質; F_oF_1-ATP合成酵素

固体NMR測定のために安定同位体を用いたF_0F_1-ATP合成酵素サブユニットcの調製法を確立し,固体NMR実験を行った。アミノ酸配列特異的に同位体標識を行える有機化学的な方法では,最初に79残基の全配列を固相法で一度に合成しする.cサブユニットの精製は,主に逆相HPLCを用いて行う.この方法の収率は5%程度であったので,比較的安価に固体NMR試料を作れるようになった.今年度はこの方法で,異なる分子鎖上にあるAla24C^βとAla64C^αのみを^<13>C標識したサブユニットcを有機合成した.この試料について核間距離を測定するため,サブユニットcを生体膜に再構成して,NMR線幅が0.5ppm程度になり分解能が最も高くなる測定条件を求めた.^<13>C,^<15>N完全標識には,大腸菌の大量発現系を用いた.精製は,有機溶媒を用いる方法で効率よく精製できることがわかり,現在大量培養を行っている.これら試料を用いることにより,固体NMR法で全構造の解析ができると考えられる.このことを明らかにするために,溶液NMRで決めた化学シフトに基づいて正確にシミュレートした3次元固体NMRスペクトルについて,各残基の信号を分離して帰属できるかどうかを調べた.その結果,隣接するC^α炭素間などについての3次元等方化学シフト相関スペクトルを測定することにより,信号幅が1ppm程度ならば,ほぼすべての信号帰属が可能なことがわかった.また,今年度はこれ以外に,多次元相関スペクトルを用いて実際のペプチドの^<13>Cと^<15>N信号の帰属が可能なことを,15残基のペプチドであるマストパランXに応用して,二次構造を求められることを確かめた.まだサブユニットcの構造決定に至っていないが測定条件と測定法の確立により,これからの固体NMRによる構造決定のための基礎ができた.

Solid NMR measurement の た め に stability with a body を い た F_0F_1 - ATP synthetase サ ブ ユ ニ ッ ト c の を established し modulation method, solid NMR be 験 を line っ た. Specific に ア ミ ノ acid with column with a line body logo を え る な method of organic chemistry で は, initially に 79 residues の whole assortment を solid-phase method で once に synthesis し す る. C サ ブ ユ ニ ッ ト の refined は, Lord に reverse phase HPLC を using い て う. こ の way の 収 は 5% degree で あ っ た の で, comparison of Ann 価 に solid NMR sample を as れ る よ う Youdaoplaceholder0. Our は "こ で の method, different な る molecular lock に あ る Ala24C ^ beta と Ala64C ^ alpha の み を ^ < 13 > C logo し た サ ブ ユ ニ ッ ト C を organic synthesis し た. こ の sample に つ い て を internuclear distance measurement す る た め, サ ブ ユ ニ ッ ト C を raw body membrane に again し て, NMR line width が 0.5 PPM level に な り High decomposition can が most も く な る を determination conditions for め た. ^ < 13 > C, ^ < 15 > N completely identify に は, coliform の large 発 practice while department を い た. Organic solvent refined は を with い る method で sharper rate よ く refined で き る こ と が わ か り, now a lot of training line を っ て い る. こ れ ら sample を with い る こ と に よ り, solid NMR method で whole structure analytical が の で き る と exam え ら れ る. こ の こ と を Ming ら か に す る た め に, solution NMR で definitely め た chemical シ フ ト に base づ い て に correctly シ ミ ュ レ ー ト し た 3 dimensional solid NMR ス ペ ク ト ル に つ い て, each residue の を separation し て 帰 genus で き る か ど う か を adjustable べ た. そ の results, 隣 meet す る C ^ between alpha carbon な ど に つ い て の 3rd parties such as chemical シ フ ト phase masato ス ペ ク ト ル を determination す る こ と に よ り, signal amplitude が 1 PPM level な ら ば, ほ ぼ す べ て の signal 帰 が may be な こ と が わ か っ た. ま た, our は "こ れ に, multidimensional phase masato ス ペ ク ト ル を with い て be interstate の ペ プ チ ド の ^ < 13 > C と ^ < 15 > N signal の 帰 が may be な こ と を, 15 residues の ペ プ チ ド で あ る マ ス ト パ ラ ン X に 応 with し て, secondary tectonic を o め ら れ る こ と を か indeed め た . ま だ サ ブ ユ ニ ッ ト c の structure decision に to っ て い な い が の と assay for determination of conditions established に よ り, こ れ か ら の solid NMR に よ る structure decision の た め の based が で き た.

项目成果

藤原敏道: "固体核磁気共鳴法"蛋白質 核酸 酵素. 44・4. 582-589 (1999)

藤原俊道：“固态核磁共振法”蛋白质核酸酶44・4（1999）。

Sumie Yoshioka: "Molecular Mobility of Protein in Lyophilized Formulations Linked to the Molecular Mobility of Polymer Excipients, as Determined by High Resolution ^<13>C Solid-State NMR"Pharmaceutical Research. 16. 1621-1625 (1999)

Sumie Yoshioka：“冻干制剂中蛋白质的分子迁移率与聚合物赋形剂的分子迁移率相关，通过高分辨率13 C固态NMR测定”药物研究。

Toshimichi.Fujiwara: "Compound Radio-Frequency Driven Recoupling Pulse Sequences for Efficient Magnetization Transfer by Homonuclear Dipolar Interaction under Magic Angle Spinning Conditions."J.Magn.Reson.,. 145. 73-83 (2000)

Toshimichi.Fujiwara：“复合射频驱动重耦合脉冲序列，用于在魔角旋转条件下通过同核偶极相互作用实现有效磁化转移。”J.Magn.Reson.,。

Suhkman Kim: "Osmotic Stability of Muramyl Dipeptide-Bearing Liposomes and Molecular Miscibility in Their Membranes"Bull.Chem.Soc.Jpn.,. 72. 541-548 (1999)

Suhkman Kim：“含胞壁酰二肽的脂质体的渗透稳定性及其膜中的分子混溶性”Bull.Chem.Soc.Jpn.,。

Suhkman Kim: "Osmotic Stability of Muramyl Dipeptide-Bearing Liposomes and Molecular Miscibility in Their Membranes"Bull. Chem. Soc. Jpn.. 72. 541-548 (1999)

Suhkman Kim：“携带胞壁酰二肽的脂质体的渗透稳定性及其膜中的分子混溶性”公牛。