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白血病の原因となる融合遺伝子mRNAを標的とするリボザイムの設計

设计一种针对导致白血病的融合基因 mRNA 的核酶

基本信息

批准号：
12029224
负责人：
神津知子
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Research Institute for Clinical Oncology, Saitama Cancer Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私共は、t(8;21)転座型白血病融合遺伝子AML1-MTG8をモデルとして、融合mRNAのみを選択的に切断するリボザイムを設計している。リボザイムを細胞内で継続的にかつ効率よく働かせる発現ベクターを得る目的で、RNA発現カセットの検討を行った。これまでにCMVプロモーター/polyAシグナルを持つ発現カセットを用いてリボザイムを細胞内で発現させると標的mRNAの減少が見られたが、U1snRNA、U6snRNA、tRNAmetiプロモーターを用いた場合、有効なリボザイム活性は検出されていない。今回、tRNAvalプロモーターを用いた発現カセット(多比良研より供与)にAML1-MTG8を標的とする4種のリボザイム配列を組み込み、標的部位の配列を5'-UTRにもつルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現、およびpCMV/AML1-MTG8をcotransfectionし、AML1-MTG8蛋白質発現抑制を指標にリボザイム活性を測定した。その結果、ルシフェラーゼ活性、AML1-MTG8蛋白質レベルともに抑制効果を示したリボザイム発現ベクターが一つ得られた。リボザイム転写産物の細胞内局在を検討した結果、活性を持つリボザイムは一部細胞質に検出された。一方リボザイム活性はほとんど示さないが細胞質に多く存在するものも得られた。これらの知見より、さらに高活性のリボザイム発現ベクターを得るためには、SELEXを行い最適な構造を選択する必要がある。一方、in vivoでの効果を解析するための白血病モデルマウスの作製は、TetTA/マウスとTetOP/AML1-MTG8マウスを交配し、F1マウスを得た。F1マウスの繊維芽細胞を培養し、Tetによって、AML1-MTG8遺伝子の発現が調節できることを確認した。個体レベルでのTetによる組織特異的な発現調節により白血病が発症するかどうかを検討中である。

Private public, t(8;21) Tamanoid leukemia fusion gene AML1-MTG8 をモデルとして, fused mRNA のみをselected に cut-off するリボザイムを design している.リボザイムをThe efficiency of で継続 within the cell is よく働かせる発appear ベクターをGet the purpose of で, RNA 発appears カセットの検question を行った.これまでにCMVプロモーター/polyAシグナルをhold つ発成カセThe amount of target mRNA found in the cells using the いてリボザイムを is reduced. In the case where られたが, U1snRNA, U6snRNA, tRNAmetiプロモーターを is used, the effective なリボザイムactive は検出されていない is used. This time, tRNAval プロモーターを用いた発成カセット (provided by Dobi Yoshiken) にAML1- MTG8's standard 4 kinds of のリボザイム arrangement を group み込み, the target part の arrangement 5'-UTR にもつルシフェラーゼレポーター伝子の発 appear, およびpCMV/AML1-MTG8をcotran sfection, AML1-MTG8 protein expression inhibition index and the activity of AML1-MTG8 protein were measured.その results, ルシフェラーゼactivity, AML1-MTG8 protein レベルThe inhibitory effect of the ともにをshows the したリボザイム発appears and the ベクターが一つgetsられた. The result of リボザイム転written product is localized in the cell and the active part is maintained in the cytoplasm. One side of the activity of リボザイムはほとんど Shows the presence of cytoplasmic に多くするものもgets られた.これらの知见より、さらにHighly active のリボザイム発成ベクターをるためには, SELEX を行いoptimal structure をselect 択するnecessary がある. one party, in vivoでのeffectをanalyticsするためのleukemiaモデルマウスのproductionは、TetTA/マウスとTetOP/AML1-MTG8 マウスをMATINGし、F1マウスを gotた. F1 cells were cultured, Tet cells were cultured, and AML1-MTG8 genes were regulated and confirmed. Individual レベルでのTetによるTissue-specific な発Now regulates によりleukemia が発 syndrome するかどうかを検褜中である.