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C型肝炎ウイルスRNAのマイクロ断片化によるウイルス増殖制御法の開発

开发丙型肝炎病毒RNA微片段化控制病毒增殖的方法

基本信息

批准号：
18659203
负责人：
小池和彦
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659203/
关键词：
C型肝炎レプリコンウイルス増殖 siRNA プロテアーゼ

项目摘要

肝細胞癌(以下、肝癌)の約80%がC型肝炎ウイルス(HCV)感染症に起因している。リバビリン併用ペグインターフェロンによって肝癌の基礎疾患である慢性C型肝炎のおよそ60%でウイルス排除が期待される。しかし、無効例の治療には有効な肝炎制御方法がない。インターフェロン治療無効例においては、HCVの感染した肝細胞が排除されにくく、それが無効の原因であることが明らかにされている。したがって、少数残存したHCV感染肝細胞からHCVが効率よく排除されれば、慢性C型肝炎におけるIFN治療成績は飛躍的に向上することが期待される。我々は、HCV感染肝細胞には、HCVゲノム複製中間体である二本鎖RNAとHCVのプロテアーゼが特異的に存在することを利用して、HCV二本鎖RNAをDicer酵素によってHCV感染肝細胞内でsiRNA化し、肝細胞に残存するHCVを排除する治療法の開発を目指して研究を行なっている。Dicer酵素の人体への悪影響を排除するために、Dicer酵素を低活性型で導入し、HCVのNS3プロテアーゼによってHCV感染肝細胞でのみDicer酵素が高度に活性化される系を開発した。HIV protein transducing domain (ptd)配列の後にHCVNS3プロテアーゼ切断ペプチド-Dicer酵素をつなげた発現バキュロウイルスを作製し、発現タンパクptd-pep-Dicerを精製した。この精製タンパクをHuh-7細胞およびHCV NS3プロテアーゼ発現Huh-7細胞クローンに導入して、Dicer酵素の活性を基質dsRNAを添加したところ、NS3プロテアーゼ発現Huh-7細胞のみにおいてDicer酵素活性が認められた。次いで、JFH-1ウイルス増殖Huh-7.5細胞にptd-pep-Dicerタンパクを導入した。ウイルス量の減少が認められたため、定量的な解析を行なっている。

About 80% of hepatocellular carcinoma (HCC) is caused by hepatitis C virus (HCV) infection. 60% of chronic hepatitis C patients are expected to be excluded from liver cancer. There is no cure for hepatitis. HCV infection in liver cells is excluded due to the absence of HCV treatment. A small number of HCV infected hepatocytes remain, HCV efficiency is eliminated, and IFN treatment results for chronic hepatitis C are expected to improve. We aim to develop a therapeutic approach for HCV elimination by using HCV duplex RNA and Dicer enzyme in HCV infected hepatocytes and HCV replication intermediates that are specific to HCV. Dicer enzyme has been introduced into human body with low activity, and HCV NS3 protein has been introduced into human liver cells with high activity. HIV protein transduction domain (ptd) alignment after HCVNS3 protocol cut off-Dicer enzyme to develop a complete list of its functions, development of the protocol ptd-pep-Dicer to refine. The purified DNA was introduced into HCV NS3 cells, Dicer enzyme activity was detected in HCV NS3 cells, and substrate dsRNA was added to HCV NS 3 cells. JFH-1 was introduced into Huh-7.5 cells. The quantity of the product is reduced, and the quantitative analysis is carried out.