rhoがん遺伝子産物の機能とこれを介する情報伝達経路の研究

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rhoがん遺伝子はrasがん遺伝子の類似遺伝子で、その産物はrasp21と同じく低分子量GTP結合蛋白質である。我々は、ボツリヌス菌の産生するC_3菌体外酵素がこの蛋白を特異的にADPリボシル化して不活化することを見出した。本研究はこのことを利用してrho遺伝子の細胞内機能を解明することを目的としている。本年度は以下の研究を行った。1.ボツリヌスC_3酵素遺伝子の構造決定とリユンビナント蛋白の産生。ボツリヌスC型菌全DNAよりC_3酵素遺伝子をクロ-ニングし遺伝子とその前後領域の塩基配列を決定した。その結果、C_3酵素が244個のアミノ酸エリ成子分子量27,362の蛋白でN端に40個のアミノ酸よりなるシグナルペプチドをもつことが明らかとなった。これを大腸菌で発現させたところ23KDaの成熟C_3酵素蛋白が細胞外に放出された。2.rho遺伝子産物の細胞周期進行における役割の解析。Swiss3T3細胞を用い、この培養液にC_3酵素を添加することにより細胞内のrho蛋白のADPリボシル化を行わせしめ、細胞増殖と細胞周期進行に対する効果をみた。C_3酵素は時間依存的及び濃度依存的に3T3細胞の増殖を抑制した。この抑制は細胞内のrho蛋白の修飾と並行し、抗酵素抗体の前処理により消失した。C_3処理細胞の細胞周期進行を解析したところ、G_1期よりS期への進行が有意に遅延していた。このことよりrho蛋白がG_1 1S移行に何らかの役割をもつことが示唆された。3.rho蛋白の細胞接着における役割の検討ヒト血小板を用いC_3酵素処理の細胞接着における役割を検討した。洗浄血小板をC_3酵素で処理すると時間及び濃度に依存して凝集反応が阻害された。しかし刺激に伴うIP_3産生及び放出反応の阻害はみられなかった。この現象は血小板内rho蛋白のADPリボシル化と並行した。これによりrho蛋白が細胞接着の活性化に関与していることが示された。