未知の細胞不死化に関与する遺伝子のクロ-ニング

克隆参与细胞永生化的未知基因

• 批准号: 02807165
• 负责人: 池田 正明
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02807165/
• 关键词: 不死化癌遺伝子; cDNAライブラリ-; アデノウイルスE1A; Teratocarcinoma; 遺伝子クロ-ニング

目的:不死化に関係する遺伝子(群)、特にDNA腫瘍ウイルスの不死化癌遺伝子(アデノウイルスE1A遺伝子)と一部同等の機能を持つ遺伝子(群)が未分化な胎児性癌細胞(Teratocarcinoma)で発現していることが既に示唆されており、またこの様な遺伝子が口腔癌の発生にも重要な役割を果たしている可能性は充分に考えられる。一般に不死化癌遺伝子は、ラット初代培養細胞を不死化するが、単独では樹立化培養細胞をトランスホ-ムできないため検出が困難である。そこで本研究では既知の不死化癌遺伝子E1Aの機能を一部欠失した変異遺伝子を用い、ラット初代培養細胞における不死化能を相補する未知の遺伝子をヒト胎児性癌細胞のcDNAライブラリ-からクロ-ニングすることを目的とした。結果:1、E1A蛋白質のC末領域を欠失した変異遺伝子はrasとの協同作用は野生型と同様に示したが、ラット新生仔腎初代培養細胞(BRK)の不死化能を全く示さなかった。2、前記のE1A変異遺伝子を動物細胞で発現可能なベクタ-に組み込んだヒト胎児性癌細胞のcDNAライブラリ-と共にBRK細胞に導入した結果、不死化したと考えられる細胞株を一株単離した。3.単離した細胞株からDNAを抽出し、サザンブロットをおこなった結果、cDNAライブラリ-由来のDNAが2コピ-組み込まれていることが確認された。4、細胞のDNAを適当な制限酵素で切断、環状化した後、大腸菌に導入し、大腸菌ベクタ-と共にcDNAを回収する事を試みた(プラスミドレスキュウ-法)。組み込まれている2コピ-のcDNAのうち1つを回収したが、E1A変異遺伝子と共にBRK細胞に再導入しても細胞の不死化は起こさなかった。残りの1コピ-については約10種類の制限酵素を用いてプラスミドレスキュウ-を行ったが、まだcDNAの回収には成功していない。

Objective: To investigate the possibility of gene transfer in the development of undifferentiated fetal carcinoma cells (Teratocarcinoma) by DNA transfer gene (E1A gene) and its functional equivalence. In general, it is difficult to prevent the death of cancer cells in primary culture, but it is also difficult to establish culture cells in primary culture. This study aims to investigate the function of the known immortal cancer gene E1A and its complementary function in primary culture cells. Results:1. E1A protein C terminal domain was absent, and the synergistic effect of ras on wild-type and mutant BRK was fully demonstrated. 2. The E1A variant gene was introduced into BRK cells and isolated from animal cells. 3. DNA extraction from isolated cell lines, DNA sequencing, DNA 4. DNA of cells should be properly restricted by enzyme cleavage, cyclization, introduction of E. coli, and cDNA retrieval (pre-selection method). The cDNA sequence of E1A gene was reintroduced into BRK cells, and the immortal cells were reintroduced into BRK cells. About 10 kinds of restriction enzymes were successfully recovered from the 1-D cDNA library.