权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

ハウスキーピング遺伝子の転写制御-Na,K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の発現調節

看家基因的转录控制——Na,K-ATP酶α1亚基基因的表达调控

基本信息

批准号：
04044142
负责人：
川上潔
金额：
$ 3.14万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for international Scientific Research
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1993
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04044142/
关键词：
Na,K-ATPase コアプロモーター転写制御因子ハウスキーピング遺伝子サウスウェスタンクローニング試験管内転写 Na、K-ATPase 試験管内転写系 DNaseIフットプリント法メチル化干渉法イニシエーター

项目摘要

Na,K-ATPaseα1サブユニット遺伝子は、どの組織にも発現し、生存に必須なハウスキーピング遺伝子のひとつである。本遺伝子の発現には、転写開始点の上流-102から-61間のARE領域及び-49から-61間のSp1結合配列が、どのタイプの細胞においても正の制御領域として必要であること、またARE領域には、どの細胞にも発現する転写因子と、細胞及び組織特異的因子とが複数個結合し、そのレパートリーが細胞や組織によって変化することが示唆されている。また、細胞周期によってもそのレパートリーが変化することが明らかになってきた。同定された結合因子の中には既知のATF-1やHEBの他、いくつかの未同定の因子が存在するので、それらの同定、精製、cDNAクローニングを行った。また、これら上流域の因子群は、正しい転写開始点からの転写を司るコアプロモーター因子群と相互作用し発現調節を行うと考えられるので、本遺伝子におけるコアプロモーターエレメント及び因子の同定もあわせて行うことを研究目標として設定した。(1)上流域因子の同定と精製、cDNAクローニングARE領域に結合する因子をゲルシフト法で解析すると、各細胞タイプに共通するC1,C2と、筋肉やHeLa細胞で見られるC3が観察できる。これらの複合体を形成する因子を同定,精製する目的で、HeLa細胞の核抽出液からWGAカラムや特異的オリゴヌクレオチドカラムを用いて精製を行い、最終標品として分子量が約100Kdaの蛋白質を得た。この蛋白質は、Na,K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の試験管内転写を約4倍活性化する。また、精製標品の部分アミノ酸配列に基くオリゴプローブを用いたcDNAクローニングによって部分cDNAを得た。大腸菌で発現させた当該蛋白質に対する抗体によって、ゲルシフトC3複合体が形成阻害を受けるので、当該cDNAはC3因子に対するcDNAであることがわかった。今後は、完全長cDNAの単離及び構造と機能の解析を行う。また、ARE領域をプローブにサウスウエスタンスクリーニングにてHeLa細胞cDNAライブラリーを検索したところ、既知の転写因子であるHEBと、我々が新たに同定したAREB6の両クローンが単離できた。これらの因子は、細胞タイプや発現量によってNa,K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の転写を正または負に制御することが共形質転写実験によって示された。AREB6はN末側4本及びC末側3本のZnフィンガークラスターをDNA結合ドメインとして保有し、さらに両クラスターの間にはホメオドメインが存在する興味深い構造をもった転写因子である。現在、これらDNA結合ドメインの結合至適配列及び、転写活性化/抑制化ドメインを検討中である。(2)コアプロモーターエレメント及び因子の同定本遺伝子のコアプロモーター領域を解析するために、HeLa細胞株抽出液を用いて試験管内転写実験を行った。その結果、5'上流域を-102まで保持した遺伝子は効率良く転写されるが、-61ないし-49まで保持した遺伝子では、核抽出液を用いた転写は観察されなかった。核抽出液をP11カラムで分画した画分を、再構成して転写を行うと、α-アマニチンに抵抗性の転写産物が観察された。即ち、核抽出液を用いた場合にはARE配列依存性のPolIIによる転写が、また再構成画分を用いた場合には、コアプロモーターのみでのPolIIIによる転写が起こっていると考えられる。両Polymeraseによる転写に必要なエレメントをリンカー置換変異で解析したところ、TATA様配列及び転写開始点を含むイニシエーター配列が必要であることがわかった。点突然変異による解析からは、PolIIがTATA様配列全領域にわたって必要なのに対し、PolIIIでは、TATA様配列の3'側半分が必要であることがわかった。現在PolIIとPolIIIによる転写がいかにして切り替えられるのかを解明するために、PolIII特異的阻害剤であるtagetinを用いた解析を行いつつある。

Na,K-ATPaseα1サブユニット伝子は、どのorganizationにも発appearし、Survival Necessityなハウスキーピング伝子のひとつである. The main legacy of the book is the upper part of the writing starting point - 102 から - 61 room のare area and び 49 から- 61 rooms of Sp1 combined with the arrangement of the cells, the control of the field and the necessary control of the cellsこと, またARE field には, どのcell にも発appears する転WRits factors と, cell and び tissue-specific factors とがPlural combination of し, そのレパートリーがcells and tissues によって変化することがshows instigation されている.また, cell cycle によってもそのレパートリーが変化することが明らかになってきた. The combination factor of the same thing is known and the ATF-1 HEB is not the same as the combination factor.のfactor がexistent するので, それらの Same determination, purification, cDNA クローニングを行った.また、これら Upper basin factor group は、正しい転WRITE starting point からの転WRITE を Division るコアプロモーター factor group とinteraction し発existing adjustment を行うと卡えられるので、本缝子におけるコアプロモーターエレメントAnd びfactorの同定もあわせて行うことをresearch goalとしてSETした. (1) The same determination and purification of the upper basin factor, the combination of the cDNA クローニングARE field and the solution of the する factor をゲルシフト method Analyze the C1 and C2 cells common to each cell, and the muscle cells and HeLa cell cells. The これらの complex formation factor するを is determined, the purification purpose is で, and the HeLa cell nuclear extract solution is specific for WGA カラムやThe オリゴヌクレオチドカラムを is refined with いて and the final standard product is a として protein with a molecular weight of about 100Kda.このprotein, Na,K-ATPaseα1 was activated by approximately 4 times in the test tube. Part of the purified standard product, the アミノ acid ligand, is based on the いたcDNA part of the クローニングによって part of the cDNA. Escherichia coli appears when the protein に対するantibody によって、ゲルシフトC3 complex is formed If the cDNA is blocked, the C3 factor will be blocked. In the future, the isolation and analysis of the structure and function of the complete long cDNA will be carried out.また、ARE field をプローブにサウスウエスタンスクリーニングにてHeLa cell cDNA ライブラリーを検So したところ, known の転write factor であるHEBと, I 々が新たに同定したAREB6の両クローンが単利できた.これらのfactorは、Cellular タイプや発existing amountによってNa,K-ATPaseα1サブユニット伝子の転WRITE を正またはnegativeにcontrolすることが conformal quality転WRITE実験によって Show された. AREB6 contains 4 copies of the N-terminal part and 3 parts of the C-terminal part of the DNA binding system. There is a し、さらに両クラスターの间にはホメオドメインが existence するinterest deep いstructure をもった転write factor である. Now, the これらDNA-binding ドメインの is bound to the aptamer and び, and the activating/inhibitory ドメインを検恧ある is written. (2)コアプロモーターエレメント和びfactorの同定本缝子のコアプロモーター collar Domain analysis is done, and the HeLa cell strain extract liquid is used in the test tube.その results, 5' upper basin を-102 までmaintained した伝子はefficiency く転写されるが, -6 1ないし-49までKEEP した伝子では, NUCLEAR EXTRACTION LIQUID を用いた転WRITE は観看されなかった. Nuclear aspirate solution をP11 カラムで分画した画分を, reconstituted して転写を行うと, α-アマニチンにresistant の転WRITING product が観看された. In other words, when the nucleic acid aspirate is used, the ARE arrangement dependence of PolII and the reconstruction of the picture are divided. Use いたoccasionには、コアプロモーターのみでのPolIIIによる転 to write が起こっていると考えられる.両Polymeraseによる転写にNecessaryなエレメントをリンカーReplacement 剉differentでanalyticsしたところ, TATA様array and び転WRITE starting point を include むイニシエーターarray がであることがわかった. Point sudden change analysis is necessary, PolII is arranged in all areas, and PolII is necessaryに対し, PolIII では, TATA様matching arrangement の3' side half がであることがわかった. Now PolIIとPolIIIによる転WRITEがいかにしてCUTTINGえられるのかを解明するために、PolIII-specific blocking agent であるtagetin を Use いたanalyze を行いつつある.