内皮型NO合成酵素遺伝子-786C変異に結合する新規リプレッサーのクローニング

一酸化窒素(NO)は、動脈硬化はじめ様々な心血管病との関連が示唆されている。我々と熊本大学循環器内科の泰江等は共同で、内皮型NO合成酵素(eNOS)遺伝子の5'転写調節領域に3つの点突然変異とエクソン7にmissense mutation(Glu298Asp)を発見し、これらの遺伝子変異が冠攣縮性狭心症と有意に相関していることを報告してきた。さらに、リポータージーンアッセイの結果、5'転写調節領域の3つの点突然変異はeNOS遺伝子の転写を低下させており、eNOS遺伝子が冠攣縮性狭心症の原因遺伝子である可能性が示唆された。さらに最近の予備研究から3つの点突然変異の中では-786C変異が転写活性の低下に寄与しており、同部位にリプレッサーが結合している可能性を示唆する実験結果が得られ、このリプレッサーは新規の蛋白質の精製を試みた。ヒト臍帯静脈内皮細胞の核蛋白質を約200μg用い、目的の蛋白質は、DEAEセファロースに吸着し、NaCl濃度0.5Mで活性は溶出された。-786Cを中心にした30bpのオリゴDNAを用いてアフィニティービーズを用いて精製し、SDS-PAGEで展開すると約70KDの位置に銀染で染色されるバンドが確認された。アミノ酸の一次構造を決定するためには、更に大量の核蛋白質が出発材料として必要であるため、Hela細胞にも同一の蛋白質が大量に存在していることから、Hela細胞の核蛋白質を出発材料として同様の精製ステップを経て目的の蛋白質の精製に成功した。アミノ酸配列を決定したところそれはDNAの修復に関与していることが知られているreplication protein Aと同一蛋白質であった。今後はこの蛋白質の機能解析を行う予定である。

一酸化窒素(NO)は、動脈硬化はじめ様々な心血管病との関連が示唆されている。我々と熊本大学循環器内科の泰江等は共同で、内皮型NO合成酵素(eNOS)遺伝子の5'転写調節領域に3つの点突然変異とエクソン7にmissense mutation(Glu298Asp)を発見し、これらの遺伝子変異が冠攣縮性狭心症と有意に相関していることを報告してきた。さらに、リポータージーンアッセイの結果、5'転写調節領域の3つの点突然変異はeNOS遺伝子の転写を低下させており、eNOS遺伝子が冠攣縮性狭心症の原因遺伝子である可能性が示唆された。さらに最近の予備研究から3つの点突然変異の中では-786C変異が転写活性の低下に寄与しており、同部位にリプレッサーが結合している可能性を示唆する実験結果が得られ、このリプレッサーは新規の蛋白質の精製を試みた。ヒト臍帯静脈内皮細胞の核蛋白質を約200μg用い、目的の蛋白質は、DEAEセファロースに吸着し、NaCl濃度0.5Mで活性は溶出された。-786Cを中心にした30bpのオリゴDNAを用いてアフィニティービーズを用いて精製し、SDS-PAGEで展開すると約70KDの位置に銀染で染色されるバンドが確認された。アミノ酸の一次構造を決定するためには、更に大量の核蛋白質が出発材料として必要であるため、Hela細胞にも同一の蛋白質が大量に存在していることから、Hela細胞の核蛋白質を出発材料として同様の精製ステップを経て目的の蛋白質の精製に成功した。アミノ酸配列を決定したところそれはDNAの修復に関与していることが知られているreplication protein Aと同一蛋白質であった。今後はこの蛋白質の機能解析を行う予定である。