T細胞活性化の一分子イメージング解析

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T細胞の抗原特異的な活性化において、活性化シグナルを伝達する重要な分子が集合して存在し、シグナル伝達の場であるlipid raftを可視化する目的で、lipid raft局在分子LATの細胞内ドメインをEGFPに置換したLAT-GFPを、アクチンプロモーターを用いて全身性に発現するトランスジェニックマウスを作製した。このLAT-GFPマウスではどの細胞もGFPを発現し、リンパ球もほとんどがGFP陽性であった。T細胞やマスト細胞では細胞表面とともに内部にもGFPが検出された。これら細胞由来のライセートを超遠心分画法で解析し、LAT-GFPはTriton不溶性のlipid raft分画に存在していることが判明した。この正常細胞に発現しているlipid raftを代表するLAT-GFPを2つの方法で解析した。(1)刺激をしない状態で、lipid raftに存在するGFPがどのような状態であるかを、リアルタイム蛍光一分子イメージング解析を行った。一分子レベルの解析では、LAT-GFPは非常に早い速度で細胞内外を入れ替わっていった。より解像度を下げると複数のGFP分子が同一の挙動をする基点を形成しており、raftの単位と考えられた。(2)人工的に作った脂質二重膜を用いたPlanar membraneのシステムを用いて、T細胞を活性化したときのLAT-GFPの動態を解析した。MHCクラスIIとICAM-1のGPI結合型分子を精製し、脂質二重膜に埋め込んだ膜上に、LAT-GFP発現T細胞を反応させて免疫シナプスを形成させると、一部のLAT-GFPがシナプス中心に集まったが、多くのLAT-GFPは凝集しないままであった。T細胞活性化にraftのシナプスへの凝集が必要でないことを示しているか、または、GM1で検出してきたlipid raftとの多様性を示している可能性も考えられた。