緑濃菌の病原因子エラスターゼとアルカリプロテアーゼの構造と発現制御に関する研究

本年はエラスターゼとアルカリプロテアーゼについてその遺伝子発現制御を詳しく研究した。まずエラスターゼについてその転写因子のひとつであるlasR遺伝子をクローン化し大腸菌での発現実験を行なった。またlasR遺伝子自身の発現についてNorthern blottingで調べたところ鉄のイオンではその発現にほとんど影響を与えなかった。現在大腸菌で発現させたlasRタンパク質を抽出し、In vitro でDNA結合実験を行ない、エラスターゼプロモーターのどの部分に結合して転写を活性化しているか、また培地中に分泌される低分子量物質により活性化されるかを検討している。一方、アルカリプロテアーゼについては、まずprimer-extension実験により転写開始点を同定した。その上流には大腸菌のRNApolymeraseシグマ70の結合部位に相同性のある部分が存在した。さらに、アルカリプロテアーゼの鉄のイオンによる発現制御を調べたところ、鉄イオン10muMの濃度でその発現は非常に強く阻害されることがELISAにより分かった。またNorthern blotting とprimer-extension で調べるとこの抑制は転写の段階で起こり、fur(ferric uptake regulation)による発現制御の可能性が強く示唆された。一方、このアルカリプロテアーゼはLasR遺伝子内に変異が見つかっているPA103株でその発現が非常に低く、その転写にLasRの関与が考えられている。今回の実験で転写開始点上流にエラスターゼ遺伝子上流と高い相同領域が固定され、その結合部位である可能性が示唆された。この点についてもDNA-LasR結合実験により今後確認する。これらの研究によりエラスターゼとアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現制御について理解されると考えられる。

本年はエラスターゼとアルカリプロテアーゼについてその遺伝子発現制御を詳しく研究した。まずエラスターゼについてその転写因子のひとつであるlasR遺伝子をクローン化し大腸菌での発現実験を行なった。またlasR遺伝子自身の発現についてNorthern blottingで調べたところ鉄のイオンではその発現にほとんど影響を与えなかった。現在大腸菌で発現させたlasRタンパク質を抽出し、In vitro でDNA結合実験を行ない、エラスターゼプロモーターのどの部分に結合して転写を活性化しているか、また培地中に分泌される低分子量物質により活性化されるかを検討している。一方、アルカリプロテアーゼについては、まずprimer-extension実験により転写開始点を同定した。その上流には大腸菌のRNApolymeraseシグマ70の結合部位に相同性のある部分が存在した。さらに、アルカリプロテアーゼの鉄のイオンによる発現制御を調べたところ、鉄イオン10muMの濃度でその発現は非常に強く阻害されることがELISAにより分かった。またNorthern blotting とprimer-extension で調べるとこの抑制は転写の段階で起こり、fur(ferric uptake regulation)による発現制御の可能性が強く示唆された。一方、このアルカリプロテアーゼはLasR遺伝子内に変異が見つかっているPA103株でその発現が非常に低く、その転写にLasRの関与が考えられている。今回の実験で転写開始点上流にエラスターゼ遺伝子上流と高い相同領域が固定され、その結合部位である可能性が示唆された。この点についてもDNA-LasR結合実験により今後確認する。これらの研究によりエラスターゼとアルカリプロテアーゼ遺伝子の発現制御について理解されると考えられる。