動物細胞での相同組換え頻度をあげる分子の細胞内導入と導入法の開発

增加动物细胞同源重组频率的分子的细胞内导入及导入方法的开发

• 批准号: 05255207
• 负责人: 河野 憲二
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05255207/
• 关键词: 相同組換え; 遺伝子ターゲッティング; RecA; 核移行; ジフテリア毒素; EF-2

動物細胞でのターゲティングの頻度を測るための簡便な検定系を開発するとともに、相同組換え頻度をあげるための1つの試みとして、大腸菌由来ではあるが現在最もその性質の明らかになっている相同組換え酵素RecAを動物細胞内に導入しその効果をみた。相同組換え検出系は、点突然変異によりジフテリア毒素に耐性となったペプチド鎖伸長因子2(EF-2)を利用した。すなわち毒素耐性型EF-2遺伝子のプロモーターを含む第1エクソンを欠き、3'側フランキング領域に第2の選択マーカーであるneo遺伝子を挿入したpXEF2neoをターゲティングベクターとした。これにより、毒素耐性かつG418耐性のコロニーの数を測定するだけで相同組換え頻度を算出できるようになった。さらに大腸菌由来のRecAタンパクのC末側に核移行シグナルを付加したT-RecAを作成し、動物細胞の核内で機能するようにRecAを改変した。このT-RecAは野生型RecAと同様の生理活性をもち、動物細胞で発現させると予想通り核に局在することを明らかにした。このT-RecAを恒常的に発現している細胞E13やE11を用いて、上記の検定系で相同組換え頻度を測定した結果、野生型のCHO細胞よりも相同組換え頻度が約3倍程度あがっているという結果を得た。T-RecAにより組換え頻度があがっているとしたら、プラスミド-プラスミド間での相同組換えも効率よく行なわれると考えられる。そこでDR、DLという一部欠損をしたNEO遺伝子をもつプラスミドを両方同時に細胞内に導入しG418耐性を示す細胞のコロニー数を野生型細胞とE13細胞やE1細胞との間で比較した。残念ながら現在までのところ有意な頻度の上昇は認められていない。単鎖のプラスミドを用いるなど今後のさらなる検討が必要である。

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项目成果

Y.Kimata & K.Kohno: "Elongation factor 2 mutants deficient in diphthamide show temperature-sensitive cell growth." J.Biol.Chem.269 (in press). (1994)

木田勇

Y.Kimata & K.Kohno: "Expression of non-ADP-ribosylatble diphtheria toxin-resistant elongation factor 2 in Saccharomyces cerevisiae" Biochem.Biophys.Res.Commun.191. 1145-1151 (1993)

木田勇

Kenji Kohno,et al.: "The promoter region of the yeast KAR2 gene contains a regulatory domain that responds to the presence----." Molecular and Cellular Biology. 13. 877-890 (1993)

Kenji Kohno 等人：“酵母 KAR2 基因的启动子区域包含一个调节结构域，可以对 ---- 的存在做出反应。”