毒素受容体を介した標的細胞ノックアウト法の開発

开发毒素受体靶细胞敲除方法

• 批准号: 14658272
• 负责人: 河野 憲二
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658272/
• 关键词: 細胞ノックアウト法; ジフテリア毒素; HB-EGF; 肝炎モデル; 糖尿病モデル; 膵臓β細胞; 疾患モデルマウス; 標的細胞ノックアウト法; 肝炎モデルマウス

1 人工毒素受容体の作製:増殖因子活性を失い且つ毒素結合活性を維持している変異型毒素の作製を行った。DT(ジフテリア毒素)とHB-EGF(毒素受容体)とが結合した状態の3次構造は明らかにされており、結合に重要なアミノ酸やその領域(EGF相同領域)も明らかにされている。逆にEGFやTGFの研究により、どのアミノ酸が変異すると増殖因子としての活性を失うかも報告されている。これらの情報を総合的に判断し蛋白質立体構造をシミュレートすることにより、純粋毒素受容体を得るために必要なアミノ酸変異部位候補をしぼり、そのアミノ酸について部位特異的変異を導入した。具体的にはHB-EGFの5種のアミノ酸(I117,V124,R128,Y138,L148)を種々のアミノ酸に置換した変異のうち、ほぼ増殖因子活性を失ったものとして、Y138D,Y138L,L148Vの3種が、ま.た3分の1程度に低下したものとして、I117V,I117A,V14Fの3種が明らかとなった。この中でさらに毒素受容体活性を測定した結果、野生型と同様の活性を有している変異が3種(I117V,I117A,L148V)、1桁感受性が低下している変異が2種(Y138L,V124F)あることが判明した。昨年行ったプロテアーゼ耐性型のL148S/P149T HB-EGFについても現在検討中である。2 本法が肝細胞以外にも使えるかどうかを明らかにするため、インスリンプロモーター下流にHB-EGFをつないだtransgeneを作製し、膵臓ランゲルハンス島β細胞に毒素受容体を発現するトラシスジェニックマウスを作製した。これらのマウスに毒素を投与することによりβ細胞を破壊し、糖尿病が引き起こされるかどうかを確かめている。現在毒素投与により血中のグルコース濃度が顕著に上昇することが観察されており、狙い通り毒素により糖尿病を引き起こしている可能性が高いと考えている。

1. Production of artificial toxin receptors: loss of growth factor activity and maintenance of toxin binding activity DT(toxin) and HB-EGF(toxin receptor) are bound to each other. The third order structure of DT (toxin receptor) and HB-EGF (toxin receptor) in the state of binding is different from that of DT (toxin receptor). In the study of EGF and TGF, there was no change in the activity of EGF and TGF. This information is integrated to determine the protein structure, and to determine whether a pure toxin receptor is available. Specifically, five kinds of HB-EGF acids (I117,V124,R128,Y138,L148) were substituted into three kinds of HB-EGF acids, namely, Y138D, Y138L, L148V. 3 points and 1 degree lower, I117V, I117A, V14F and 3 kinds of light. The activity of these toxin receptors was determined. Three different types (I117V, I117A, L148V) and two different types (Y138L, V124F) were identified. Last year, the L148S/P149T HB-EGF was tested. 2. This method is used to control the expression of HB-EGF receptor in the downstream of liver cells. This is the first time that we've had a chance to get rid of diabetes. Now the toxin concentration in the blood is increasing, and the possibility of diabetes is high.

项目成果

Sano, H.: "Conditional ablation of striatal neuronal types containing dopamine D2 receptor disturbs coordination of basal ganglia function."J.Neuroscience. 23. 9078-9088 (2003)

Sano, H.：“含有多巴胺 D2 受体的纹状体神经元类型的有条件消融会扰乱基底神经节功能的协调。”J.Neuroscience。

Kiso, S.: "Liver regeneration in heparin-binding EGF-like growth factor transgenic mice after partial hepatectomy."Gastroenterology. 124. 701-707 (2003)

Kiso, S.：“部分肝切除术后肝素结合 EGF 样生长因子转基因小鼠的肝脏再生。”胃肠病学。

Kiso, S.: "Liver regeneration in heparin-binding EGF-like growth factor transgenic mice after partial hepatectomy"Gastroenterology. 124. 701-707 (2003)

Kiso, S.：“部分肝切除术后肝素结合 EGF 样生长因子转基因小鼠的肝脏再生”胃肠病学。