標的遺伝子組み換えによる造血幹細胞の新しい受容体型癌遺伝子c-mplの解析

靶向基因重组分析造血干细胞中新的受体型癌基因c-mpl

• 批准号: 06280209
• 负责人: 生田 宏一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06280209/
• 关键词: 標的遺伝子組み換え; サイトカイン・レセプター; マウス

1.129系マウスgenomicライブラリーの200万ファージクローンをスクリーニングし、独立した8個のクローンを得た。8個のクローンは18kbの領域を包括していた。制限酵素地図作製およびDNA配列決定により、c-mpl染色体遺伝子は12個のエクソンから成り全長16kbの領域にまたがっていることが明らかとなった。翻訳開始点は第1エクソンに、1番目のCモチーフは第2エクソンと第3エクソンに、1番目のWSモチーフは第5エクソンに、2番目のCモチーフは第6エクソンと第7エクソンに、2番目のWSモチーフは第9エクソンに、膜貫通領域は第10エクソンに、細胞質内領域は第11エクソンと第12エクソンに、翻訳終止点とポリA添加シグナルは第12エクソンに存在した2.構築したコンストラクトは相同組み換え体の同定をサザン法にて行うものである。第6エクソンのBstEII切断点にPGK1-neo polyA遺伝子を挿入し,5'側に4.5kbおよび3'側に5kbの相同DNA領域をとり、ネガティブ選択マーカーとしてMC1-TK遺伝子を用いた。このコンストラクトでは、2番目のCモチーフの中にneo遺伝子が挿入されるのでc-mplのリガンド結合能と完全に失われると考えられた。3.まず、コンストラクトCにて762個のクローンをスクリーニングし1個の相同組み換え体を同定した。この細胞(W7)は、相同組み換えを起こしたDNAのシグナルがgermlineのシグナルよりも強かった。これは、一部の細胞でもう一方の染色体も相同組み換え体に置き換わったことを示唆している。W7をC57BL/6マウスの胚盤胞に注入しキメラマウスを作成した。11匹のマウスが得られたが2匹のみがキメラマウスで、いずれも雌でキメリズムは低かった。これらのキメラマウスをC57BL/6雄マウスと交配したがES細胞の性質を伝えた(agoutiの)仔マウスは得られなかった。

1.129 2 million copies of the original order. 8 of the 18kb fields are included. The restriction enzyme gene is used to determine the DNA sequence. The c-mpl chromosome sequence contains 12 fragments. The length of the fragment is 16kb. Turn start point: 1st, 2nd, 3rd, 5th, 6th, 9th, membrane penetration field: 10th, cytoplasmic field: 11th, 12th 2. Construction of the same set of components, the same set of components. The PGK1-neo polyA gene was inserted at the 6th BstEII cleavage point, and the MC1-TK gene was used in the same DNA domain at the 4.5kb and 3'-side. The two groups of C + 3. 762 samples were collected and 1 sample was collected. This cell (W7) is the same group of cells that start with DNA. A part of a cell is a part of a chromosome. A part of a chromosome is a part of a chromosome. W7 BL/6 11 C57BL/6 male