標的遺伝子組み換えによる造血幹細胞の新しい受容体型癌遺伝子c-mplの解析

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1.129系マウスgenomicライブラリーの200万ファージクローンをスクリーニングし、独立した8個のクローンを得た。8個のクローンは18kbの領域を包括していた。制限酵素地図作製およびDNA配列決定により、c-mpl染色体遺伝子は12個のエクソンから成り全長16kbの領域にまたがっていることが明らかとなった。翻訳開始点は第1エクソンに、1番目のCモチーフは第2エクソンと第3エクソンに、1番目のWSモチーフは第5エクソンに、2番目のCモチーフは第6エクソンと第7エクソンに、2番目のWSモチーフは第9エクソンに、膜貫通領域は第10エクソンに、細胞質内領域は第11エクソンと第12エクソンに、翻訳終止点とポリA添加シグナルは第12エクソンに存在した2.構築したコンストラクトは相同組み換え体の同定をサザン法にて行うものである。第6エクソンのBstEII切断点にPGK1-neo polyA遺伝子を挿入し,5'側に4.5kbおよび3'側に5kbの相同DNA領域をとり、ネガティブ選択マーカーとしてMC1-TK遺伝子を用いた。このコンストラクトでは、2番目のCモチーフの中にneo遺伝子が挿入されるのでc-mplのリガンド結合能と完全に失われると考えられた。3.まず、コンストラクトCにて762個のクローンをスクリーニングし1個の相同組み換え体を同定した。この細胞(W7)は、相同組み換えを起こしたDNAのシグナルがgermlineのシグナルよりも強かった。これは、一部の細胞でもう一方の染色体も相同組み換え体に置き換わったことを示唆している。W7をC57BL/6マウスの胚盤胞に注入しキメラマウスを作成した。11匹のマウスが得られたが2匹のみがキメラマウスで、いずれも雌でキメリズムは低かった。これらのキメラマウスをC57BL/6雄マウスと交配したがES細胞の性質を伝えた(agoutiの)仔マウスは得られなかった。