標的遺伝子組み換えと胚盤胞相補法によるサイトカイン受容体遺伝子の機能解析

利用靶向基因重组和囊胚互补法对细胞因子受体基因进行功能分析

• 批准号: 06670345
• 负责人: 生田 宏一
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670345/
• 关键词: IL-7レセプター; 標的遺伝子組み換え; マウス

1 IL-7レセプター遺伝子の単離IL-7レセプターのcDNAを既知のDNA配列を参考にしてPCRにより単離した。次に、得られたcDNAをプローブとして129系マウスgenomicライブラリー200万個より染色体遺伝子を単離し、制限酵素地図作製およびDNA配列決定により遺伝子のエクソン・イントロン構造を明らかにした。IL-7レセプター染色体遺伝子は8個のエクソンから成り全長40kbの領域にまたがっていることが明らかとなった。Cモチーフを含む第2エクソンをneo遺伝子に置き換えたベクター(A)とWSモチーフを含む第5エクソンと膜貫通領域を含む第6エクソンを同時にneo遺伝子に置き換えたベクター(B)を作製した。どちらのベタク-においてもIL-7レセプター分子は完全に不活されると考えられた。ネガティブ選択としてはHSV-TK遺伝子を用いた。2 相同組み換え体の単離ES細胞(E14.1.B8)にエレクトロポレーションによりDNAを導入し、G418とFIAUにより細胞を選択し生き残ったコロニーを単離し、相同組み換えの有無をサザン法により解析した。その結果、1回目のスクリーニングでAベクターでは119個中1個の相同組み換え体が得られたが、Bベクターでは104個調べたが得られなかった。2回目のスクリーニングはAベクターに集中し、145個中2個の相同組み換え体が得られた。3 キメラマウスの作成最初に得られたES細胞は形態が悪かったのでサブクローニングし、良い形態のサブクローンを2個をC57BL/6J-Ly-5.1マウスの胚盤胞に注入しキメラマウスの作成した。その結果、その内の1クローンからキメラマウスが得られた。今後、残る2クローンを胚盤胞に注入する予定である。

1 IL-7 レセプター弝子の単利 IL-7 レセプターのcDNA をKnown DNA sequence reference にしてPCR により単lea した. The 129th line of られたcDNA をプローブとして line マウスgenomic ライブラリー 2 million より chromosomal inheritance The DNA sequence is determined by the enzyme-restricted enzyme and the enzyme-restricted DNA sequence. IL-7 has a total length of 40kb and has a total length of 8 chromosomes. Cモチーフをむ 2nd エクソンをneo 伝子に putきchange えたベクター (A) とWS モチーフを捀 5th エThe クソンと film penetrates the field and contains the 6th エクソンを at the same time, and the にneo legacy 伝子に屋きchanges えたベクター (B) を した.どちらのベタク-においてもIL-7レセプターmolecule は completely に不生されると卡えられた.ネガティブ选択としてはHSV-TK 伝子を用いた. 2 Isolated ES cells (E14.1.B8) of the same group were replaced with DNA-introduced G41 8とFIAUによりcellを选択し生き residualったコロニーを単leaし, the same group ofみchangeえの有无をサザン法によりanalyticsした.その results, 1 episode of のスクリーニングでAベクターでは 1 out of 119 is the same Set み change the body が got られたが, B ベクターでは 104 tunes べたが got られなかった. 2 chapters of the same set of のスクリーニングはAベクターにconcentration, and 2 of the same group out of 145 are replaced by the body. 3キメラマウスの initially created ES cell morphology が悪かったのでサブクローニングし, good shape のサブクローンを2 pieces of をC57BL/6J-Ly-5.1 マウスのblastoderm cells were injected into しキメラマウスのした.そのRESULT, その内の1クローンからキメラマウスが得られた. From now on, it is scheduled to be injected into the remaining blastoderm cells.