蛋白質の活性に着目した、新しい網羅的遺伝子解析の試み

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我々は、それぞれの活性を介して発現が変化する遺伝子の同定に必要な、ATP結合、重合、膜リン脂質結合、ATPase活性部位に変異を持つ、温度感受性dnaA変異株の作成を行った。そして重合活性に関する変異株とDNAチップ技術を用いて、変異により発現が変化する遺伝子の同定を行った。数多くの遺伝子が同定されたが、特にDnaKなど分子シャペロン関連の遺伝子が多かった。一方我々はGST Pull-downアッセイを用いた方法で、DnaAの重合活性依存にDnaAに結合する蛋白質を検索した。興味深いことにやはり分子シャペロンが同定された。以上の結果から我々は、DnaAの重合に分子シャペロンが関与しているのではないかと考え、実際に記験管内複製再構成系を用いて、精製したDnaKがDnaへの重合を促進し、DNA複製を促進することを見出した。これまでdnaK変異株がなぜdnaの性質を示す(DNA複製を行えない)のかは不明であったが、この研究によりDnAへの重合を促進するためであることが分かった。一方、ATP結合活性に関しても同様の解析を行い、DnaB蛋白質(DNAヘリカーゼ)とDnaAの結合がDnaAのATP結合に依存していることを見出した。この結果は、ATP結合型DnaAがDnaBを複製開始点に導入し複製が開始され、その後、DnaAのATPase活性が促進されDnaAがADP型に変化するとDnaBがDnaへから離れ複製反応が進行する(DNAヘリカーゼは複製フォークと共にゲノム上を移動する必要がある)という機構の存在を示唆している。一方我々は酵母の複製開始蛋白質ORCに関してこれまで、DnaAとの共通性という独自の観点から生化学的に研究してきた。その結果ORCもDnaA同様、ATP結合、ATPase、膜結合、重合など、様々な生化学的活性を持つ蛋白質であることが分かった。