自然突然変異抑制に働く8-oxo-dGTPaseの3次元構造に基づく機能解明

:8-oxo-dGTPaseは、活性酸素によってdGTPから生成する変異原性ヌクレオチド8-oxo-dG8-oxo-dGMPに分解し、ヌクレオチドプールから8-oxo-dGTPを取り除くことによって、DNA複製時、AT→GG突然変異を起こすA:8-oxoG不適塩基対形成を防ぐ働きをしている。本研究では、大腸菌とヒトの8-oxo-dGTPase並びに基質アナログとの複合体結晶のX線結晶構造解析を行ない、8-oxo-dGTPの認識機構、リン酸ジエステル結合切断機構を3次元構造レベルで解明することを目的とし、現在、以下の研究成果を得ている。(1) 我々は大腸菌8-oxo-dGTPaseについて、X線構造解析可能な結晶を得る条件を確立し、天然型結晶、並びに有効な重原子同型結晶である白金誘導体の回折データを高エネルギー加速器研究機構の放射光で収集し、単一同型置換法で解析、分子の境界領域が鮮明な2.2A分解能の電子密度図を得た。この電子密度図では完全なモデルの構築は難しいので、電子密度図の改善を試み、3次元構造モデルを構築している。(2) 8-oxo-dGTPase-Mn複合体結晶を調製し、同加速器研究機構の放射光を用いて、2.0A分解能の回折データを得た。本結晶でも重原子同型置換法で解析すべく、有効な重原子誘導体結晶の検索を行っている。(3) ヒト8-oxo-dGTPaseは、大腸菌のものとアミノ酸配列上の相同性が一部を除いてほとんどないのでX線構造解析は、大腸菌とは独立に重原子同型置換法で行なう。そこで、ヒト8-oxo-dGTPaseの大量発現ベクターを組み込んだ大腸菌を大量培養、8-oxo-dGTPasを大量生産させ、高純度で精製した。現在、精製試料を用いて、既に小さい結晶が得られることがわかっているPEG8000を沈殿剤をする条件を中心に、X線構造解析可能な大きさの結晶を得るべく結晶化条件の最適化を行なっている。

:8-oxo-dGTPaseは、活性酸素によってdGTPから生成する変異原性ヌクレオチド8-oxo-dG8-oxo-dGMPに分解し、ヌクレオチドプールから8-oxo-dGTPを取り除くことによって、DNA複製時、AT→GG突然変異を起こすA:8-oxoG不適塩基対形成を防ぐ働きをしている。本研究では、大腸菌とヒトの8-oxo-dGTPase並びに基質アナログとの複合体結晶のX線結晶構造解析を行ない、8-oxo-dGTPの認識機構、リン酸ジエステル結合切断機構を3次元構造レベルで解明することを目的とし、現在、以下の研究成果を得ている。(1) 我々は大腸菌8-oxo-dGTPaseについて、X線構造解析可能な結晶を得る条件を確立し、天然型結晶、並びに有効な重原子同型結晶である白金誘導体の回折データを高エネルギー加速器研究機構の放射光で収集し、単一同型置換法で解析、分子の境界領域が鮮明な2.2A分解能の電子密度図を得た。この電子密度図では完全なモデルの構築は難しいので、電子密度図の改善を試み、3次元構造モデルを構築している。(2) 8-oxo-dGTPase-Mn複合体結晶を調製し、同加速器研究機構の放射光を用いて、2.0A分解能の回折データを得た。本結晶でも重原子同型置換法で解析すべく、有効な重原子誘導体結晶の検索を行っている。(3) ヒト8-oxo-dGTPaseは、大腸菌のものとアミノ酸配列上の相同性が一部を除いてほとんどないのでX線構造解析は、大腸菌とは独立に重原子同型置換法で行なう。そこで、ヒト8-oxo-dGTPaseの大量発現ベクターを組み込んだ大腸菌を大量培養、8-oxo-dGTPasを大量生産させ、高純度で精製した。現在、精製試料を用いて、既に小さい結晶が得られることがわかっているPEG8000を沈殿剤をする条件を中心に、X線構造解析可能な大きさの結晶を得るべく結晶化条件の最適化を行なっている。