权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

転写因子の「下流遺伝子」単離法の開発

开发分离转录因子“下游基因”的方法

基本信息

批准号：
12877020
负责人：
横田義史
金额：
$ 1.22万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877020/
关键词：
転写因子下流遺伝子クローニング

项目摘要

個々の転写因子が発現調節を行う「下流遺伝子」の同定は極めて困難である。本研究の目的はその方法を開発する事にある。本研究で開発をめざした「下流遺伝子」の単離法は、目的とする転写因子の抗体を必要とすることなく迅速に行えるという特徴を持つ。まず、SV40複製開始点を持つプラスミドに、SV40 large T抗原cDNAをthymidine kinase遺伝子由来のminimal promoterの制御下になるよう挿入した。ついで、このプラスミドのminimal promoterの上流にマウスのゲノム断片を挿入し、マウスゲノムライブラリーを構築した。「下流遺伝子」の同定を目指す転写因子としてPax3を選び、このcDNAの哺乳動物発現ベクターを構築した。これらを同時にサルの腎臓由来のCV-1細胞に導入すると、Pax3の結合領域を含むゲノム断片を挿入されたプラスミドはSV40 large T抗原の発現によりSV40複製開始点を介して著明な増幅を受けると考えられた。これらの細胞からHirt法を用いてプラスミドを回収した後、同様のアッセイを繰り返すことにより、目的とするPax3結合領域を含むゲノム断片が単離できると予想された。しかし、報告されているPax3結合配列を含むDNA断片をpositive controlとしても、濃縮は確認できなかった。SV40 large T抗原に対する抗体で検討したところ、プラスミドを導入した多くのCV-1細胞でSV40 large T抗原の発現がみられ、系が動かない原因は高いバックグラウンドによると考えられた。今後は、いかにバックグラウンドを実用レベルにまでおとすか、という点を検討する必要がある。

The factors of each factor appear to regulate the behavior of "downstream genes" and determine the extreme difficulties. The purpose of this study is to develop a new method. This study aims to develop a method for identifying the "downstream genes" and to identify the characteristics of these genes. SV40 replication start point, SV40 large T antigen cDNA, thymidine kinase gene origin and minimal promoter control In the middle of the process, the minimum promoter of the first step is constructed. "Downstream cDNA" identity refers to the construction of a mammalian gene expression vector, such as Pax3. The expression of SV40 large T antigen in CV-1 cells was detected at the same time as that of Pax3 binding domain. The Hirt method is used to analyze the structure of the cell, and the structure of the cell is used to analyze the structure of the cell. Pax3 binding sequence contains DNA fragments, which are identified by concentration. SV40 large T antigen antibody detection, detection, and expression of SV40 large T antigen in CV-1 cells. In the future, it is necessary to discuss the following points: