Wntリガンドの動態計測に基づく組織発生機構の解析

本研究では、分泌シグナルの拡散状態の違いに注目し、それを生み出す分子機構とその生物的意義を検討することを研究の中心に据え、以下の３つの問いを設定している。(1) 複数の複合体構造や異なる拡散性を取りうるという特徴は、Wntの種類や発現細胞の違いに関わらず共通にみられることか、それとも多様性があるのか。(2)拡散性が異なる状態への移行はどのように制御されるのか。(3)低拡散状態と高拡散状態の各々が持つ生物学的意義とは何か。これらの問いに対して、今年度に得られた主たる成果は以下のとおりである。(1) 内在のWntが実際に複合体を形成するのかを検討するために、Wnt3aが発現することが知られている胎生７日相当のエピブラストを誘導する培養系の確立を試みた。しかしながら、誘導効率が十分ではなく、目的とする細胞を効率よく誘導するための条件検討を引き続き行う予定である。 (2) ゲノム編集により樹立した内在のWntに蛍光蛋白を付加さたノックインフィッシュを用いて、内在性Wntの観察・測定を引き続き行った。その結果、蛍光付きタンパク質は比較的高い拡散能を有していることが蛍光相関分光解析より明らかになったが、その一方で実際にWntが付加した蛍光タンパク質の拡散が本当に高いのかどうかについてはより慎重な解析が必要であるとの結論に達した。(3) 前年度までの解析により、WntおよびsFRPの種類により相互の結合性が異なることが示されたことから、その特異性の意義を培養細胞系とアフリカツメガエルの初期胚を用いて解析した。その結果、WntとsFRPが複合体形成することと、細胞膜表面への親和性の間には相関関係があり、sFRPと複合体を形成することによってWntは細胞膜上の特定タンパク質(HSPG)と結合するものと考えられた。さらに、HSPGと Wnt3aとの結合性を免疫沈降法により確認した。

本研究では、分泌シグナルの拡散状態の違いに注目し、それを生み出す分子機構とその生物的意義を検討することを研究の中心に据え、以下の３つの問いを設定している。(1) 複数の複合体構造や異なる拡散性を取りうるという特徴は、Wntの種類や発現細胞の違いに関わらず共通にみられることか、それとも多様性があるのか。(2)拡散性が異なる状態への移行はどのように制御されるのか。(3)低拡散状態と高拡散状態の各々が持つ生物学的意義とは何か。これらの問いに対して、今年度に得られた主たる成果は以下のとおりである。(1) 内在のWntが実際に複合体を形成するのかを検討するために、Wnt3aが発現することが知られている胎生７日相当のエピブラストを誘導する培養系の確立を試みた。しかしながら、誘導効率が十分ではなく、目的とする細胞を効率よく誘導するための条件検討を引き続き行う予定である。 (2) ゲノム編集により樹立した内在のWntに蛍光蛋白を付加さたノックインフィッシュを用いて、内在性Wntの観察・測定を引き続き行った。その結果、蛍光付きタンパク質は比較的高い拡散能を有していることが蛍光相関分光解析より明らかになったが、その一方で実際にWntが付加した蛍光タンパク質の拡散が本当に高いのかどうかについてはより慎重な解析が必要であるとの結論に達した。(3) 前年度までの解析により、WntおよびsFRPの種類により相互の結合性が異なることが示されたことから、その特異性の意義を培養細胞系とアフリカツメガエルの初期胚を用いて解析した。その結果、WntとsFRPが複合体形成することと、細胞膜表面への親和性の間には相関関係があり、sFRPと複合体を形成することによってWntは細胞膜上の特定タンパク質(HSPG)と結合するものと考えられた。さらに、HSPGと Wnt3aとの結合性を免疫沈降法により確認した。