無細胞系を用いたヌクレオソーム構造に特異的なDNA修復機構の解析

使用无细胞系统分析特定于核小体结构的 DNA 修复机制

• 批准号: 08772094
• 负责人: 益谷 央豪
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772094/
• 关键词: ヌクレオチド除去修復; 色素性乾皮症; ヌクレオソーム; XPC; hHR23B

SV40のミニ染色体を用いた無細胞ヌクレオチド除去修復系の精製因子による再構成を目指し、まず、裸のDNA上の損傷の修復に必要なヌクレオチド除去修復因子を組み換え蛋白質として発現して精製した。これらのうち、XPC-hHR23B複合体について、XPCのみではなく、hHR23Bもヌクレオチド除去修復に必要な因子であることを明かにした。さらに、そのDNA結合活性について解析し、この蛋白質複合体が一本鎖および二本鎖および二本鎖のDNAに強く結合し、さらに紫外線を照射したDNAに強い親和性を持つことを明かにし、これが、DNA損傷の認識に関与していることを示唆した。また、この蛋白質複合体は、細胞内でも、DNAに強く結合していることを確認した。XPF-ERCC1複合体についても、昆虫細胞ウイルスの蛋白質発現系を用いて、発現し、精製することに成功した。この蛋白質複合体は、XPAカラムに強く結合したことからXPAと相互作用すること、また、構造特異的なエンドヌクレアーゼ活性を持つことを明かにした。このヌクレアーゼ活性は、DNA損傷の5′側を切断すると考えられる。すでに、これらのほかに、XPG、RPAを組み換え蛋白質として、またヒト細胞より精製したTFIIHを手に入れており、裸のDNA上における損傷の切り出し反応に必要最小限の因子をそろえることができた。しかしながら、さらにその効率を上げる因子が複数存在していると予想される。現在、これらの因子の同定、および、ヌクレオソーム上の損傷に必要な因子の同定を進めている。

SV40 の ミ を ニ chromosomes with い た cell free ヌ ク レ オ チ ド remove repair is の refined factor に よ る reconstitution を refers し, ま ず, naked の の の on DNA damage repair に necessary な ヌ ク レ オ チ ド remove repair factor み を group in え protein と し て 発 now し て refined し た. こ れ ら の う ち, XPC - hHR23B complex に つ い て, XPC の み で は な く, hHR23B も ヌ ク レ オ チ ド remove repair に な necessary factor で あ る こ と を Ming か に し た. さ ら に, そ の DNA binding activity に つ い て analytical し, こ の protein complex が a lock お よ び 2 lock お よ び 2 lock の DNA に く combining し, さ ら に を exposure to the sun's ultraviolet rays し た DNA に い strong affinity を hold つ こ と を Ming か に し, こ れ が, DNA damage の に masato and し て い る こ と を in stopping し た. Youdaoplaceholder0, とを <s:1> protein complex た, intracellular で で, DNAに strong く binding, <s:1> て る る とを とを confirm た た. XPF - ERCC1 complex に つ い て も, insect cell ウ イ ル ス の protein 発 now is を い て, 発 し now, refined す る こ と に successful し た. こ の protein complex は, XPA カ ラ ム に strong く combining し た こ と か ら XPA と interaction す る こ と, ま た, structure specific な エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ active を hold つ こ と を Ming か に し た. The activity of を and DNA damage on the 5 'side of <s:1> を cut すると are tested for えられる. す で に, こ れ ら の ほ か に, XPG, RPA み を group in え protein と し て, ま た ヒ ト cells よ り refined し た TFIIH を hand に into れ て お り, naked の DNA に お け の り cutting out し る injury against 応 に necessary minimum の factor を そ ろ え る こ と が で き た. The げる factor が complex number exists on the を of the を and さらにそ of the さらにそ efficiency を. The て and ると ると are similar to される. Now, こ れ ら の factor の, お with よ び, ヌ ク レ オ ソ ー ム の damage on に な factor の with necessary を into め て い る.

项目成果

van der Spek,P.J.et al.: "XPC and human homologs of RAD23 : intracellular localization and relationship to other nucleotide excision repair complexes." Nucl.Acids Res.24. 2551-2559 (1996)

van der Spek,P.J.等人：“XPC 和 RAD23 的人类同源物：细胞内定位以及与其他核苷酸切除修复复合物的关系。”

Sugasawa,K.et al.: "HHR23B,a human RAD23 homoloque,stimulates XPC protein in nucleotide excision repar in vitro." Mol.Cell.Biol.16. 4852-4861 (1996)

Sugasawa, K. 等人：“HHR23B，一种人类 RAD23 同源物，在体外核苷酸切除修复中刺激 XPC 蛋白。”

Saijo,M.et al.: "Sequential binding of DNA repair proteins RPA and ERCC1 to XPA in vitro." Nucl.Acids Res.24. 4719-1724 (1996)

Saijo,M.et al.：“DNA 修复蛋白 RPA 和 ERCC1 在体外与 XPA 的顺序结合。”

Ito,K.et al.: "c-jun stimulates origin-dependent DNA unwinding by polyomavirus large T antigen" EMBO J.15. 5636-5646 (1996)

Ito,K.et al.：“c-jun 通过多瘤病毒大 T 抗原刺激起源依赖性 DNA 解旋”EMBO J.15。