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色素性乾皮症蛋白質の無細胞DNA除去修復系および転写系における役割

着色性干皮病蛋白在无细胞 DNA 切除修复和转录系统中的作用

基本信息

批准号：
08264221
负责人：
益谷央豪
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264221/
关键词：
ヌクレオチド除去修復色素性乾皮症 XPC HHR23B HHR23A TFIIH

项目摘要

1)XP-C群細胞抽出液を分画・再構成し、XPC、HHR23B、HHR23Aの3者を、全て含まない無細胞NER系を構築した。この系では、XPC単独では低いNER活性しか示さず、HHR23Bの共存下で、XPCのNER活性が促進された。また、HHR23Bのかわりに、HHR23Aを加えても同様の効果を示した。これらのことから、XPCばかりでなくHHR23BもNERに関与していること、また、HHR23BとHHR23Aは機能的に互換性のある蛋白質であることが示された。2)HeLa細胞より精製したXPC-HHR23B複合体は、一本鎖DNAセルロースカラムに非常に強く結合したことから、DNA結合活性を持つことが示唆された。そこで、ゲルシフト法を用いて、そのDNA結合活性について検討した。XPC-HHR23B複合体は、一本鎖および二本鎖のDNAにともに結合したが、二本鎖DNAにより強く結合した。また、紫外線を照射したDNAにより高い親和性を示したことから、DNA損傷の認識に関与していることが示唆された。3)基本転写因子TFIIHの構成成分の一つであるp62に特異的な抗体を用いて、免疫沈降を行ったところ、ヒトのNERの正常な細胞の抽出液中よりTFIIHとともにXPCが共沈降した。精製したTFIIHとXPC-HHR23Bを用いた実験においても、抗p62抗体によりTFIIHとともにXPC-HHR23Bが共沈降した。さらに、GSTとの融合蛋白質として発現・精製したGST-HHR23Bを用いて、TFIIHとの結合について検討した結果、GST-HHR23BとTFIIHの結合は検出されなかったが、XPCの共存下では、TFIIHがGST-HHR23BおよびXPCとともに共沈降した。これらのことから、TFIIHとXPCが直接相互作用していることが示された。

1) XP-C group cell extract liquid was isolated and reconstructed, XPC, HHR23B, HHR23A were divided into three types, and the whole cell-free NER system was constructed. It shows that XPC alone has low NER activity and HHR23B coexists, and XPC promotes NER activity.また, HHR23B のかわりに, HHR23A を加えても Same 様のeffect をshow した.これらのことから、 The functions of HHR23B and HHR23A are interchangeable and the proteins are compatible with each other. 2) HeLa cell purified XPC-HHR23B complex, Ipponlock DNA The ースカラムに is very strong and strong in binding, and the DNA-binding activity is strong and strong.そこで, ゲルシフト法を Use いて, そのDNA binding activity について検した. XPC-HHR23B complex は, one lock およびtwo locks のDNA にともにcombination したが, two locks DNA によりstrong くcombination した.また、Ultraviolet rays irradiation したDNA によりHigh compatibility をshow したことから、DNA damage のsensitivity and していることが Show 唆された. 3) The basic components of TFIIH are the use of antibodies specific for p62 and immunoprecipitation. The normal cells of the NER and the extracted fluid are co-sedimented with TFIIH and XPC. The purified TFIIH and XPC-HHR23B were co-precipitated with the anti-p62 antibody TFIIH and XPC-HHR23B.さらに、GST とのfusion protein として発appear・refined したGST-HHR23B を Use いて、TFIIH とのcombination について検検したresults、GST-HH The combination of R23B and TFIIH is the same as the coexistence of XPC, and the coexistence of TFIIH and GST-HHR23B is the coexistence of XPC and coexistence.これらのことから、TFIIHとXPCがDirect interaction していることがshow された.