新規シグナル分子単離を目指した遺伝学的スクリーニング法の開発

开发用于分离新信号分子的遗传筛选方法

• 批准号: 15659118
• 负责人: 黒崎 知博
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659118/
• 关键词: 劣性遺伝子; DT40; 変異; アッセイ系; GFP遺伝子; ノックイン

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchickenDT40細胞において、chromosomeのcetromere,telemere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を特異的にdeletionすることが可能である。既にこの方法を用いてchickenに存在するchromosomeの1、2、3のdeletion作成した。次にchromosome dessectionにより、1、2、3のchromosomeのgenomic bank (約20-50kb/clone)をつくり、その際in vitroで化学変異源を用いそれぞれのgenomic cloneに変異をいれると同時に哺乳類薬剤markerであるneo遺伝子を導入した。一方、DT40細胞のアッセイ系をGFPで光学的に容易に検出できるようシステムを構築した。Bcl-2遺伝子は、NF-KB径路により強く制御されているので、Bcl-2遺伝子プロモーター領域にGFP遺伝子をノックインの方法を用いて導入した。実際、NF-KB径路を活性化するシグナルをこの細胞に加えるとGFPの顕著な上昇が認められ、システムとして用いることができることを判明した。又、このBcl-2/GFPを導入したDT40細胞を用いて、変異を導入し、かつneo遺伝子を導入したgenomic bankをトランスフェクションして約1000個のクローンを得た。

Mammalian cells の occasions, recessive but 伝 を 単 from し た い, more く の posthumous son 伝 が diploid exist で す る こ と が handicap of に な る. こ の た め, both に chickenDT40 cells に お い て, chromosome の cetromere, telemere weeks 辺 の heritage 伝 with sequence は decided さ れ て い る の で, the same group in え を using し て あ る の specific chromosome (chicken に は 5 this existence す る) の wrist of long and short The を specific にdeletionする とが may である. That is, the に て <s:1> <s:1> method を uses the に てchickenに to make the するchromosome <s:1> 1, 2, 3 deletions into た た. Subに chromosome sections によ, 1, 2, 3 chromosome chromosome genomic banks (about 20-50 KB /clone)を を く <e:1> <e:1>, そ <s:1> in vitroで chemical variations を using に それぞれ genomic cloneに mutation を れると れると れると simultaneously に mammalian drug markerであるneo legacy 伝 を import to た た. One side, DT40 cells <s:1> アッセ offspring are をGFPで optical に, which is easy to に検 で るようシステムを るようシステムを るようシステムを construct た た. The Bcl - 2 heritage 伝 は, NF - KB path に よ り strong く suppression さ れ て い る の で, Bcl - 2 but 伝 プ ロ モ ー タ ー field に GFP heritage 伝 son を ノ ッ ク イ ン の way を with い て import し た. Be international, NF - KB path を activeness す る シ グ ナ ル を こ の cells に plus え る と GFP の 顕 through な が recognize め ら れ, シ ス テ ム と し て in い る こ と が で き る こ と を.at し た. Again, こ の Bcl - 2 / GFP を import し た DT40 cells を using い て, - different を import し, か つ neo heritage 伝 son を import し た genomic bank を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し て about 1000 の ク ロ ー ン を た.

项目成果

Kurosaki, T.: "Checks and balances on developing B cells."Nat.Immunol.. 4. 13-15 (2003)

Kurosaki, T.：“检查和平衡发育中的 B 细胞。”Nat.Immunol.. 4. 13-15 (2003)

Yamazaki, T., Kurosaki, T.: "Contribution of BCAP to maintenance of mature B cells through c-Rel."Nat.Immunol.. 4. 780-786 (2003)

Yamazaki, T., Kurosaki, T.：“BCAP 通过 c-Rel 对成熟 B 细胞维持的贡献”Nat.Immunol.. 4. 780-786 (2003)