新しい分泌蛋白・膜表面蛋白クローニング法の開発

新型分泌蛋白/膜表面蛋白克隆方法的开发

基本信息

批准号：
05670120
负责人：
仲野徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670120/
关键词：
シグナルペプチド cDNAライブラリー分泌蛋白膜表面蛋白

项目摘要

まず、マウス骨髄に由来するストロマ細胞であるST2細胞からmRNAを抽出し、ランダムプライマーをもちいてcDNAを合成し、5'側をdG tailingした後、オリゴdCをプライマーとして二本鎖にした。超音波破砕器で200-400塩基対に断片化して得られたcDNA断片を、プロモーターと、リーダーペプチドの部分を除いたTac遺伝子の間に結合した。この融合cDNAライブラリーの中から、数百個のプラスミドのプールを作製し、そのプールをCos7細胞にトランスフェクトした後抗Tac抗体で表面染色をおこなった。細胞表面にTac蛋白が存在する場合には、そのプラスミドプールのなかにリーダーペプチドをコードするcDNAが含まれていると考えられるので、プールの中からさらにリーダーペプチドをもつプラスミドを選び出し、得られたクローンの塩基配列を決定した。また、リーダーペプチドを有すると考えられるcDNA断片をプローブに用して、全長cDNAの単離ならびにシークエンスを行なった。このような独創的な発想を持つスクリーニング法(シグナルシークエンストラップ法)により、極めて簡便かつ効率的に分泌蛋白あるいは膜表面蛋白を単離できるようになった。大規模なスクリーニングを行ない、十数個の未知のクローンを得ることに成功している。現在その構造を解析中である。また、そのうちの一つのクローンはインタークラインファミリーに属する新しいサイトカインであることが明かとなった。

首先，从ST2细胞（一种源自小鼠骨髓的基质细胞）中提取mRNA，使用随机底漆，DG尾巴尾巴进行5'侧，然后以寡聚式底漆为单位合成cDNA。通过使用超声破坏器碎片分成200-400个碱基对获得的cDNA片段在启动子和TAC基因之间结合，不包括领导者肽的一部分。从这个融合cDNA文库中，制备了数百个质粒的池，并将池转染到COS7细胞中，然后用抗TAC抗体染色。当TAC蛋白存在于细胞表面时，据认为，质粒池包含编码铅肽的cDNA，因此从池中选择了携带铅肽的进一步质粒，并确定获得的克隆的基本序列。另外，将全长cDNA分离并使用cDNA片段进行测序，该cDNA片段被认为具有铅肽作为探针。这种发明的筛选方法（信号测序带方法）使得非常方便，有效地分离分泌的蛋白质或膜表面蛋白。它已成功进行了大规模筛选，并成功获得了十几个未知克隆。目前正在分析该结构。还揭示了这些克隆之一是属于Intercline家族的新细胞因子。