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新しい分泌蛋白・膜表面蛋白クローニング法の開発

新型分泌蛋白/膜表面蛋白克隆方法的开发

基本信息

批准号：
05670120
负责人：
仲野徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670120/
关键词：
シグナルペプチド cDNAライブラリー分泌蛋白膜表面蛋白

项目摘要

まず、マウス骨髄に由来するストロマ細胞であるST2細胞からmRNAを抽出し、ランダムプライマーをもちいてcDNAを合成し、5'側をdG tailingした後、オリゴdCをプライマーとして二本鎖にした。超音波破砕器で200-400塩基対に断片化して得られたcDNA断片を、プロモーターと、リーダーペプチドの部分を除いたTac遺伝子の間に結合した。この融合cDNAライブラリーの中から、数百個のプラスミドのプールを作製し、そのプールをCos7細胞にトランスフェクトした後抗Tac抗体で表面染色をおこなった。細胞表面にTac蛋白が存在する場合には、そのプラスミドプールのなかにリーダーペプチドをコードするcDNAが含まれていると考えられるので、プールの中からさらにリーダーペプチドをもつプラスミドを選び出し、得られたクローンの塩基配列を決定した。また、リーダーペプチドを有すると考えられるcDNA断片をプローブに用して、全長cDNAの単離ならびにシークエンスを行なった。このような独創的な発想を持つスクリーニング法(シグナルシークエンストラップ法)により、極めて簡便かつ効率的に分泌蛋白あるいは膜表面蛋白を単離できるようになった。大規模なスクリーニングを行ない、十数個の未知のクローンを得ることに成功している。現在その構造を解析中である。また、そのうちの一つのクローンはインタークラインファミリーに属する新しいサイトカインであることが明かとなった。

The mRNA of ST2 cells was extracted and the cDNA was synthesized on the 5'side of ST2 cells. The ultrasonic disruptor is 200-400 nm in diameter, and fragments of cDNA are obtained. This fusion cDNA fragment was produced in the middle of the cell line, hundreds of fragments were produced, and Cos7 cells were stained with anti-Tac antibodies. The expression of Tac protein on the surface of a cell is determined by the selection and alignment of Tac protein in the cell surface. The length of cDNA fragments was determined by the length of cDNA fragments. This is an original method of developing protein secretion, which is extremely simple and effective. Large-scale search and rescue operations, dozens of unknown search and rescue operations successfully completed. Now the structure is analyzed. A new type of vehicle is required.