エリスロポエチン受容体を介した赤血球細胞増殖分化機序の解析

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エリスロポエチン(Epo)受容体の細胞質部位の種々の変異体,欠失体構築を作成し、IL3依存性細胞に導入後そのシグナル伝達能をMTTアッセイで行い,受容体の生理作用部位を同定した。その結果,IL2受容体β鎖とアミノ酸配列の相同性の高い領域が増殖シグナルに重要であることが判明した。また、IL2βやIL3受容体とのハイブリッド体を生成した結果からも、Epo受容体の情報伝達が他のサイトカインと共通である可能性が示唆された。細胞外のWSXWSモチ-フ部を欠失させるとEpoの結合能が欠くなるので、現在各アミノ酸置換体を作成し解析している。Epo受容体を大腸菌を用いてIPTGで誘導可能な発現系で作成し,ウサギに免疫して抗血清を作成した。現在,機能サブユニットの同定を抗体を用いて急いでいる。Epo受容体をcos〓又はL細胞に発現させ、その結合を調べた所、高親和性と低親和性の二種類の受容体が観察され,受容体のβサブユニットの存在,又は相合性の可能性が示唆された。またクロスリンクさせると主に65KDaの蛋白が同定された。可溶性受容体を発現ベクタ-に導入発現させ、その細胞上清のEpo結合に及ぼす効果を調べた所,Epoへの特異的な結合が観察され,分子量29KDaの蛋白はツニカマイシン存在下で種鎖のない蛋白を合成させた。可溶性受容体を大量精製することにより,その抗体をウサギより作成することと、そのin vivoにおける生理機能の解析を行う。また、ヒトEpo受容体cDNAを単離した所82%の塩基配列上相同性が認められ,可溶性受容体もalternatine splicingにより作られることを証明した。Epo受容体遺伝子の発現は、赤血球特異的転写制御因子GATAー1がEpo受容体プロモ-タ-活性を20倍増幅させることがcoーtraus fectionアッセイの結果得られ,フットプリント法によりその結合ドメインがGATA配列であることを証明した。