上皮成長因子の情報伝達網の細胞内1分子可視化解析

表皮生长因子信息转导网络的细胞内单分子可视化分析

• 批准号: 12215086
• 负责人: 佐甲 靖志
• 金额: $ 3.01万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12215086/
• 关键词: EGF; EGF受容体; GFP; Grb2; Ras; Raf1; SH_2ドメイン; リン酸化

本研究は、上皮成長因子(EGF)により活性化される細胞増殖のための細胞内情報伝達網の働きを、細胞内で1分子計測し、解析することにより、増殖信号の伝達機構を解明することを目的とする。細胞における1分子測定は、これまでに報告がなかった。最近、我々は細胞の細胞表面でEGF分子の1分子可視化に成功し、EGF受容体の局在と運動、さらに分子間相互作用を細胞内で1分子測定することが可能になった。これらの1分子測定法をさらに発展させることにより、研究を進めている。本年度はEGFの情報伝達素過程の細胞内1分子追跡法の開発をおこなった。その結果、EGFの活性化を認識する抗体や、各種緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質などを用いて、以下の情報伝達素過程を細胞内で1分子追跡することができるようになった。(1)EGF受容体の自己リン酸化反応の1分子可視化自己リン酸化により構造変化したEGF受容体を特異的に認識する抗体を蛍光標識し、EGF受容体に結合した蛍光EGFと2色同時観察することによる。(2)EGF受容体とアダプター蛋白質の相互作用の1分子可視化EGF受容体を認識するアダプターGrb2タンパク質のSH2ドメインを大腸菌で発現・精製し蛍光標識した。(3)Ras,Raf-1の細胞内1分子可視化GFP変異体のひとつYFPとの融合タンパク質として細胞内に発現させたRas,Raf1を生きている細胞内で1分子可視化し、その運動を追跡することができるようになった。

This study aimed to clarify the mechanism of cellular signaling and expression of EGF in vitro. Cell phone number 1 molecular assay, cell phone number 1 molecular assay. Recently, we have successfully visualized EGF molecules on the cell surface, and it is possible to determine the molecular interaction between EGF receptors and intracellular molecules. The first molecular assay was developed. This year, the development of an intracellular molecular tracing method for EGF signaling processes was initiated. The results showed that EGF activation was recognized by antibodies, various green fluorescent proteins (GFP) and fusion proteins, and the following signaling processes were tracked in cells. (1)EGF receptor self-acidification reaction 1 molecular visualization of self-acidification, structural transformation, EGF receptor specific recognition, antibody light identification, EGF receptor binding, EGF 2 color simultaneous detection. (2) Molecular visualization of EGF receptor and protein interactions; recognition of EGF receptor; identification of EGF receptor. (3) Molecular visualization of Ras,Raf-1 in the intracellular 1 molecule, and molecular tracking of Ras,Raf-1.

项目成果

Y.Sako,K.Hibino,T.Miyauchi,Y.Miyamoto,M.Ueda & T.Yanagida: "Single-Molecule lmaging of Signaling Molecules in Living Cells"Single Molecules. 1. 159-163 (2000)

Y.Sako、K.Hibino、T.宫内、Y.Miyamoto、M.Ueda

F.Kano,Y.Sako,M.Tagaya,T.Yanagida.& M.Murata: "Reconstitution of brefeldin A-induced Golgi-tubulation and its fusion with the ER in semi-intact CHO cells"Mol.Biol.Cell.. 11. 3073-3087 (2000)

F.卡诺，Y.Sako，M.田谷，T.柳田。

Y.Sako,S.Minoguchi & T.Yanagida: "Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells"Nature Cell Biology. 2. 168-172 (2000)

萨科·美野口