唾液腺癌細胞の骨芽細胞分化メカニズムの探索

探讨唾液腺癌细胞成骨细胞分化机制

• 批准号: 02F00541
• 负责人: 佐藤 光信
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00541/
• 关键词: 22-oxa-1α,25(OH)_2D_32; マイクロアレイ; PDK2; ヒト唾液腺癌細胞; BMP-2; Cbfa1; Smad1; 5; 8; オキサ型ビタミンD3

我々は、HSG-AZA3細胞において22-oxa-1α,25(OH)_2D_3処理にて発現変化のおこる遺伝子をcDNAマイクロアレイ法を用い単離した。その結果、pyruvate dehydrogenase kinase,isoenzyme 2(PDK2)にて11倍、Calcitoninにて4.6倍、zinc finger protein 177にて3.4倍、chloride channel,calcium activated,family member 1にて3.3倍の発現上昇を認めた。また一方で、elastin(supravalvular aortic stenosis,Williams-Beuren syndrome)にて7.4倍、6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha(TCF1)にて4.8倍の、TATA box binding protein(TBP)-associated factor,RNA polymerase III,GTF3B subunit 2にて4.2倍の発現低下を認めた。そのため、上記遺伝子に対する特異的PCRプライマーを設定後、10^<-7> Mの22-oxa-1α,25(OH)_2D_3処理後のHSG-AZA3細胞より抽出したcDNAを用いた半定量性RT-PCR法にて発現変化を再確認したところ、有意な発現変化を認めたものはPDK2のみであった。そのため、NCBIのゲノムドラフトシークエンスにより、ホモロジー検索にてPDK2のプロモーター領域をクローニングした。その結果、プロモーター領域には約280bpのスペーサーを挟んで、2箇所のビタミンD応答配列(aggtca)があることが明らかになった。このプロモーター領域をゲノムPCRにて増幅し、ルシフェラーゼレポーターベクター(pGL3-basic)に組み替えた後、HSG-AZA3細胞にトランスフェクションし、22-oxa-1α,25(OH)_2D_3にて処理したところ、約4倍のルシフェラーゼ活性の上昇を認めた。しかしながら、HSG細胞においても同程度の活性上昇を認めたことから、22-oxa-1α,25(OH)_2D_3によるPDK2の発現上昇は、骨芽細胞への分化の必須条件ではないことが推察された。しかしながら、PDKファミリーは解糖系からTCA回路を結ぶ重要な酵素であるpyruvate dehydrogenase^<67)>を不活性化させる酵素の一つであることから、我々の結果は22-oxa-1α,25(OH)_2D_3の作用機序にPDK2の発現上昇によるTCA回路の不活性化機構が存在することが示唆している。

HSG-AZA3 cells were treated with 22-oxa-1α,25(OH)_2D_3 and transformed into cDNA. Results: Pyruvate dehydrogenase kinase,isoenzyme 2(PDK2) increased 11-fold, Calcitonin increased 4.6-fold, zinc finger protein 177 increased 3.4-fold, chloride channel,calcium activated,family member 1 increased 3.3-fold. The expression of elastin(supravalcular aortic stenosis,Williams-Beuren syndrome) was 7.4 fold, 6-pyrivoyl-tetrahydropterin synthase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha(TCF1) was 4.8 fold, TATA box binding protein(TBP)-associated factor,RNA polymerase III,GTF3B subunit 2 was 4.2 fold. The <-7>cDNA extracted from HSG-AZA3 cells treated with 22-oxa-1α, 25 (OH)_2D_3 was reconfirmed by semi-quantitative RT-PCR. The NCBI has to be able to monitor PDK2's development. As a result, the domain of the domain is about 280bp, and the domain of the domain is about 280 bp. After the PCR amplification, the activity of HSG-AZA3 cells was increased by about 4-fold after the PCR amplification, 22-oxa-1α, 25 (OH)_2D_3 processing. The activity of PDK2 in HSG cells increased to the same extent, and the necessary conditions for differentiation of bone bud cells were investigated. The results showed that the inactivation mechanism of the TCA loop exists in the presence of PDK2 in the pathway of 22-oxa-1α,25(OH)_2D_3.