無脊椎動物(カブトガニ)血球細胞上のリポ多糖受容体の遺伝子クローニングと機能解析

无脊椎动物（鲎）血细胞脂多糖受体基因克隆及功能分析

基本信息

批准号：
08680692
负责人：
牟田達史
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

FITCラベルしたLPSを用いたflow cytometryによる解析により、カブトガニ血球細胞はLPS応答性の哺乳類細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことを見い出した。細胞表面への結合にはhemolymphplasma成分は要求されず、過剰量の無標識LPSによって拮抗がかかること、さらにprotease処理によって結合の減少がみられることから、血球細胞表面に、LPSを直接特異的に認識し結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子の実体を明らかにするため、現在、下記のような方法でExpression cloningを進めている。まず、哺乳動物細胞での強力なpromoterであるelongation factor promoterの下流にカブトガニ血球細胞由来cDNAを導入したplasmid expression cDNA libraryを構築した。次に、このlibraryを約2,000cloneづつのsubpoolに分けてplasmidを調製し、LPS結合性を示さないCOS7細胞にcalcium phosphate法により導入した。カブトガニ由来cDNAを発現させた後、上記のflow cytometryの系を利用して、細胞のLPS結合能を検討することにより、陽性クローンを含んだsubpoolを検索しつつある。現在、flow cytometryを用いた検出では、backgroundが高いという欠点があるため、ビオチン化したLPSを用いて、培養ディッシュ上で細胞を染め、陽性反応を示す細胞の同定も同時に試みている。

使用FITC标记的LPS进行的流式细胞仪分析表明，与LPS响应性的哺乳动物细胞相比，马蹄蟹血细胞具有非常强的LPS结合能力。与细胞表面结合不需要结合，并且可以拮抗过多的标记LPS，并且蛋白酶处理降低了结合，这表明直接识别LP并直接在血细胞表面上结合LPS。为了阐明该因素的实质，我们目前正在通过以下方式进行表达克隆：首先，构建了质粒表达cDNA文库，其中在该图中构建了马蹄蟹血细胞衍生的cDNA，在延伸因子启动子的下游引入了延伸因子启动子，这是哺乳动物细胞中有效的启动子。接下来，将该文库分为大约2,000个克隆的子池以制备质粒，而磷酸钙方法引入了未表现出LPS结合的COS7细胞。从马蹄蟹表达cDNA后，上述流式细胞仪系统用于研究细胞的LPS结合能力，并寻找含有阳性克隆的子池。当前，使用流式细胞术的检测具有高背景的缺点，因此我们还试图使用生物素化LPS同时在培养皿上染色细胞，以鉴定具有阳性反应的细胞。