無脊椎動物(カブトガニ)血球細胞上のリポ多糖受容体の遺伝子クローニングと機能解析

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FITCラベルしたLPSを用いたflow cytometryによる解析により、カブトガニ血球細胞はLPS応答性の哺乳類細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことを見い出した。細胞表面への結合にはhemolymphplasma成分は要求されず、過剰量の無標識LPSによって拮抗がかかること、さらにprotease処理によって結合の減少がみられることから、血球細胞表面に、LPSを直接特異的に認識し結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子の実体を明らかにするため、現在、下記のような方法でExpression cloningを進めている。まず、哺乳動物細胞での強力なpromoterであるelongation factor promoterの下流にカブトガニ血球細胞由来cDNAを導入したplasmid expression cDNA libraryを構築した。次に、このlibraryを約2,000cloneづつのsubpoolに分けてplasmidを調製し、LPS結合性を示さないCOS7細胞にcalcium phosphate法により導入した。カブトガニ由来cDNAを発現させた後、上記のflow cytometryの系を利用して、細胞のLPS結合能を検討することにより、陽性クローンを含んだsubpoolを検索しつつある。現在、flow cytometryを用いた検出では、backgroundが高いという欠点があるため、ビオチン化したLPSを用いて、培養ディッシュ上で細胞を染め、陽性反応を示す細胞の同定も同時に試みている。